老龄垃圾渗滤液是指垃圾经长期填埋、性质逐渐稳定后产生的渗滤液，是垃圾填埋处置过程中的必然副产物，其水质具有复杂性、高污染性和易变性，且生化性差，毒性极大.老龄垃圾渗滤液中难降解的有毒有机物主要分为持久性有机物、多种异生生物质和内分泌干扰物(EDCs)3种.烷基酚壬基酚(NP)、辛基酚(OP)和双A(BPA)是渗滤液中最常检测出来的内分泌干扰物，如张晶等(2007)检测到北京某垃圾填埋场中NP、BPA、OP的浓度分别为11.3~14.2 μg · L^-1、1.4~2.8 μg · L^-1和40.5~4.3 μg · L^-1；Asakura等(2004)检测到日本某垃圾填埋场渗滤液中BPA、OP和NP的浓度分别为0.07~228 μg · L^-1、0.11~0.42 μg · L^-1和0.05~0.07 μg · L^-1；Yamamoto等(2001)在国外某垃圾填埋场渗滤液中检测到BPA浓度为1.3~17200 μg · L^-1；Boonnorat等(2014)、Xu等(2011)和Asakura等(2009)也在渗滤液中检测到了酚类内分泌干扰物.大量的调查和研究表明，EDCs对女性乳腺癌、子宫癌发病率增加、男性精子数量及质量的下降、雄性动物的雌性化、部分生态系统中动物雌雄比例失调等具有不可忽视的作用(Asakura et al., 2004; Mol et al., 2000; Nina et al., 2013; Sayed et al., 2012;Matsushima et al., 2013).如何有效地去除渗滤液中EDCs，尤其是对现有技术处理后的生态毒性的研究，并开展环境及人类健康的风险评估，已成为当今环境研究领域的热点.

老龄渗滤液由于毒性大、可生化性差，污水的生物处理方法已不再适合.目前采用较多的是催化氧化法，如潘云霞等(2009)、Yang(2007)、李平等(2012)利用太阳光Fenton或单独Fenton预处理老龄渗滤液，对COD_Cr的去除率均在60%以上.虽然催化氧化法处理效果较好，但由于其药剂费用高，反应装置复杂，处理成本高等原因，实际应用有一定困难.而IME-Fenton是IME法与Fenton法的结合，特点是利用IME反应结束后产生大量的Fe²⁺，在酸性条件下加入H₂O₂可构成Fenton试剂.该方法可集混凝、吸附及高级氧化于一体，对高浓度有机废水及有毒物质的降解效果好，环境二次污染少，已被广泛研究及应用，但处理后废水的生物毒性研究鲜见报道.

查阅文献发现，体外生物分析方法评价EDCs雌激素效应是最有效和最具发展前途的方法，可以对背景复杂样品中痕量组分及药物成分进行分析，主要包括生物传感器、免疫测定法等(沈登辉等，2012).细胞实验是经典的测定雌激素效应的方法，常用的是酵母和人体乳腺癌细胞.Wang等(2012)用MCF-7细胞增殖实验筛选出具有雌激素效应的PFOS化合物，李延等(2003)采用MTT法测试了11种酚类化合物对鲫鱼淋巴细胞增殖的影响.基于此，本文选择对雌激素敏感的MCF-7细胞进行体外培养，采用MTT法测定酚类雌激素对MCF-7细胞的增殖和划痕损伤来探讨老龄渗滤液经IME-Fenton处理后酚类物质的雌激素效应，实验结果有望为开展垃圾渗滤液中环境激素的健康风险评价提供理论依据.

MCF-7细胞由暨南大学医学院实验中心(国家干细胞工程技术研究中心广东省分中心)提供.取对数期的MCF-7细胞加入到含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液(加入1%的青霉素-链霉素)中，置于37 ℃、5%的CO₂、饱和湿度的培养箱中培养.培养2~4 d后，用胰蛋白酶消化细胞，将细胞稀释至适当浓度传代(刘英华等，2011).

DMEM高糖培养液、无酚红的DMEM培养液、胎牛血清、青霉素-链霉素、2.5%的胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液(北京Thermo公司)，二甲基亚砜(DMSO，BIOSHARP公司)；主要仪器包括洁净工作台(SW-OJ-2F)、CO₂水套培养箱(3111)、Biotek酶标仪(Eon)、冰箱(BCD-539WL)、倒置显微镜(Nikon TS100)、立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-75KBS)、旋转蒸发器(RE-52A)、高效液相色谱仪(1100)、QTRAP质谱仪(ABI4000).

无激素的胎牛血清：取10 mL的双蒸水于25 mL的离心管内，加入0.5 g的活性炭和0.05 g的葡聚糖苷在800 r · min^-1转速下离心10 min，弃去上清液；再向离心管内加入1 mL的10%的氯化钠，摇匀，最后加入20 mL胎牛血清，在55 ℃的水浴锅中卵育45 min，并在800 r · min^-1转速下离心20 min，收集上清，重复离心一次，0.22 μm滤膜过滤，即得到处理后的胎牛血清，于-20 ℃下保存备用(卫立等，2006；屈海娜，2010).

PBS缓冲液：取99 mL的磷酸盐缓冲液加入到可封口且灭菌后的瓶内，加入1 mL的双抗，即得到PBS溶液，密封后在-4 ℃冰箱中保存.

MTT试剂：称取50 mg的MTT于烧杯中，然后加入10 mL的PBS溶液或磷酸盐缓冲液，用磁力搅拌机搅拌30 min.用装有0.22 μm滤膜的注射器过滤除菌，装于灭菌瓶内封口并用铝箔纸包装，在-20 ℃冰箱内保存备用.

老龄渗滤液取自广州某已封场12年的垃圾填埋场，用棕色玻璃器皿取回后于4 ℃下保存，测定渗滤液原液水质指标如表 1所示.

表1(Table 1)

表1 渗滤液原液水质指标 Table 1 Characteristics of aged l and fill leachate

表1 渗滤液原液水质指标 Table 1 Characteristics of aged l and fill leachate pH COD/(mg · L-1) BOD5/COD NH4-N/(mg · L-1) NP/(μg · L-1) OP/(μg · L-1) 8.1~8.7 3300~4500 <0.1 3000~5500 2.7~10.6 1.4~5.2

用0.45 μm滤膜分别过滤渗滤液原液、IME和IME-Fenton处理后的渗滤液，再分别取10 mL，用超纯水稀释至500 mL.用6 mol · L^-1的盐酸调节溶液pH=2~3，倒入1 L分液漏斗中，分别加入15、15和10 mL的CH₂Cl₂萃取3次.将3次萃取液收集到同一个旋转蒸馏瓶中，用旋转蒸发仪浓缩至约0.5 mL，用恒定流速的氮气吹干(张奎文等，2008).加入约5 mL的正己烷，旋转蒸发浓缩至约2 mL，经过5%活化硅胶柱分离提纯，即先用20 mL的二氯甲烷/正己烷(V/V，3 ∶ 7)混合溶剂淋洗后，再用40 mL的二氯甲烷/正己烷(V/V，8 ∶ 2)混合溶剂淋洗并收集，淋洗液经旋转蒸发浓缩至干.加入DMSO，定容至1 mL，再通过0.22 μm的滤膜除菌，即获得渗滤液原液、IME和IME-Fenton处理后渗滤液酚类提取物，分别记为A、B、C样品，并把它们的浓度定为单位1，于-20 ℃冰箱中保存备用.

将浓度定为单位1的A、B、C样品都用无激素的DMEM培养基(90%的无酚红的DMEM高糖培养液，10%无激素的胎牛血清，1%的青霉素-链霉素)和无激素的培养液(含0.1%青霉素-链霉素的无酚红的DMEM培养液)进行稀释，分别稀释10~10⁷倍.则A、B、C经稀释后都得到相对浓度为10^-1~10^-7的7个备用样品，并分别测得不同浓度暴露下的A、B、C样对MCF-7细胞的增殖和迁移效应.

渗滤液用6 mol · L^-1的硫酸调溶液pH=2，投加还原铁粉(Fe⁰)与活性炭粉末(GAC)的质量比为2 ∶ 1，其中，GAC=10 g · L^-1，经过IME处理90 min后，再用6 mol · L^-1的硫酸调溶液pH=3，加入30%(质量分数)的H₂O₂的量为渗滤液的1%，反应60 min(Zhao et al., 2014)，即IME过程产生的Fe²⁺与加入的H₂O₂形成Fenton处理IME处理后的渗滤液，该条件为本课题组研究的IME-Fenton去除老龄渗滤液COD，提高生化性的最佳条件.

利用外源性的MTT能被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成不溶性的蓝色结晶物甲臜并沉积在细胞中，二甲基亚砜(DMSO)能使细胞中的甲臜溶解，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其吸光度，可间接反映活细胞数量，而死细胞则无此功能.收集对数期的MCF-7细胞，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液调整细胞悬液浓度约为10³个 · mL^-1，接种于96孔板，每孔100 μL；于培养箱内在37 ℃、5%的CO₂、饱和湿度的条件下培养24 h，使细胞贴壁后弃去培养液；用PBS清洗后换为无激素的DMEM培养基在上述条件下培养2~3 d，弃去培养基；再用PBS清洗，然后分别加入含有A、B、C样(每个样品的相对浓度都依次为10^-7~10^-1)且无激素的DMEM培养基，设DMSO作为溶剂对照组，每组实验设置3个平行.继续分别培养48、72、96 h后，加入10 μL已经配置好的MTT溶液，再培养4~6 h，吸取上清液舍弃.加入100 μL的DMSO，在摇床上低速振荡10 min，充分溶解.用酶联免疫检测仪(波长 490 nm)测得各孔的OD值，计算该浓度下的酚类提取物对MCF-7细胞的增殖效应(Proliferation Effect，PE)，公式如下：

同IME-Fenton处理渗滤液初始条件一样，将渗滤液用6 mol · L^-1的硫酸调溶液pH=2，加入GAC 10 g · L^-1，反应30、60、90 min后，参考2.3节步骤用CH₂Cl₂提取吸附后的渗滤液，净化稀释后测定经活性炭吸附后渗滤液中酚类提取物的雌激素效应. 2.4.4 划痕实验 取对数期的MCF-7细胞，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液调整细胞悬液浓度约为10⁴个 · mL^-1，接种于6孔板，每孔1 mL；于37 ℃、5%的CO₂、饱和湿度的培养箱内培养24 h后移去培养液，再用PBS清洗并换为无激素的DMEM培养基在上述条件下培养2~3 d，弃去培养基；再用100 μL的枪头末端在6孔板的中央作划痕，用PBS轻轻吹洗划落的细胞碎片，分别加入含有A、B、C(每个样品的相对浓度都依次为10^-7~10^-1)且无激素的DMEM培养液，置于培养箱中继续培养，采用显微镜在40×物镜下记录在不同时间段不同浓度酚类提取物对划痕伤口的愈合情况.

为了确定活化硅胶柱净化后渗滤液原液提取物为酚类物质，用HPLC-MS对甲醇定容后的提取物进行检测.HPLC以甲醇和水作为流动相进行梯度洗脱；MS采用电喷雾离子源(ESI)负离子模式的多重反应监测(MRM)扫描：CUR=30 psi，GSI=55 psi，GS2=50 psi，CAD=High，IS=-4500 V，雾化温度为400 ℃.NP和OP的母离子分别为219.30和205.30，碎片离子均为133.30，具体结果见图 1.由图 1可知，提取物主要成分为酚类的NP和OP.

图1(Fig.1)

图1 渗滤液酚类提取物MRM谱图 Fig.1 MRM of phenols extracts from leachate

渗滤液处理前后水质指标见表 2.由表 2可知，IME方法的COD去除率达到了68.2%，BOD₅/COD由0.08提高到了0.27；经IME-Fenton处理后，COD去除率达到了80.6%，BOD₅/COD提高到了0.35.这与任健等(2011)、Antonio等(2004)和Krishna等(2001)用IME-Fenton处理水样结果一致，说明用IME-Fenton在本研究探讨的条件下处理渗滤液对其COD去除及BOD₅/COD的提高有较好的效果.

表2(Table 2)

表2 渗滤液处理前后的水质指标 Table 2 Comparison of the characteristics of l and fill leachate before and after treatment

表2 渗滤液处理前后的水质指标 Table 2 Comparison of the characteristics of l and fill leachate before and after treatment 渗滤液类型 COD/(mg · L-1) BOD5/COD 渗滤液原液 3342.2 0.08 IME处理后 1062.8 0.27 IME-Fenton处理后 648.4 0.35

渗滤液原液酚类提取物对MCF-7细胞增殖效应如图 2所示，在样品相对浓度为10^-7~10^-3时促进MCF-7细胞的增殖，相对浓度为10^-2~10^-1时则抑制其增殖，且在10^-5浓度下浸染72 h后增殖达到最大的275%.这是因为在浓度低时，与MCF-7细胞内雌激素受体接触的酚较少，随着酚浓度的增大接触越充分，增殖效应也相应的增大，在10^-5时增殖达到最大；当受体结合率达到平衡时，随着酚浓度继续升高，过量的酚将存于胞浆内或者被其他细胞器代谢，超过细胞的承受限时将会对细胞产生毒性.这是因为随着浸染时间的延长细胞数量会增加，细胞内雌激素受体与酚结合越充分，故增殖越大.在浸染72 h之后增殖开始下降，一方面是因为酚的量开始减少，另一方面可能因为细胞密度过大，造成细胞的死亡.

图2(Fig.2)

图2 稀释渗滤液原液酚类提取物对MCF-7细胞增殖的影响 Fig.2 Proliferation effect of diluted phenols extracts from raw leachate on MCF-7

渗滤液经IME处理后，酚类提取物对MCF-7细胞的增殖效应如图 3所示.在样品相对浓度为10^-7~10^-3时促进MCF-7细胞的增殖，相对浓度为10^-2~10^-1时抑制增殖，且浓度在10^-4浸染72 h后增殖达到最大的190%.与渗滤液原液相比，渗滤液经IME处理后酚类提取物对MCF-7最大增殖效应的浓度降低了10倍，最大增殖效应下降了85%.这是因为渗滤液经IME处理后，渗滤液中部分酚类物质结构发生改变或被除去，也可能出现酚的同分异构体.而IME对酚的同分异构体降解难易程度不一样，酚的异构体的雌激素效应也不一样(Frederic et al., 2008)，故经过IME处理后渗滤液中酚类提取物的雌激素效应出现下降.

图3(Fig.3)

图3 稀释渗滤液经IME处理后酚类提取物对MCF-7细胞增殖的影响 Fig.3 Proliferation effect of diluted phenols extracts from leachate treated by IME on MCF-7

渗滤液经IME-Fenton处理后，酚类提取物对MCF-7的增殖效应如图 4所示.在样品相对浓度为10^-7~10^-3时促进MCF-7细胞的增殖，相对浓度为10^-2~10^-1时则抑制其增殖，且浓度在10^-4浸染72 h后增殖达到最大的165%.与渗滤液经IME处理后酚类提取物对MCF-7细胞增殖效应相比，相同浓度下增殖效应均出现了下降，在10^-4浸染72 h最大增殖下降了25%，而在其他浓度下增殖下降的幅度均低于25%.IME-Fenton过程中Fenton比IME处理后渗滤液中酚类物质的雌激素效应下降速度慢，可能是由于渗滤液在IME处理过程中生成了更难降解的小分子有机物，而Fenton试剂形成的O^-₂和· OH(Kwon et al., 2004)与IME反应形成的中间产物或酚的同分异构体进一步反应，使它们进一步降解甚至直接矿化为CO₂和H₂O.而且并不是所有酚降解的中间产物和同分异构体都有雌激素效应，故Fenton过程中雌激素效应相对IME下降的不明显.

图4(Fig.4)

图4 稀释渗滤液经IME-Fenton处理后酚类提取物对MCF-7细胞增殖的影响 Fig.4 Proliferation effect of phenols extracts from leachate treated by IME-Fenton on MCF-7

渗滤液经活性炭吸附30、60和90 min后，酚类提取物浸染MCF-7细胞72 h后的增殖效应如图 5所示.在相对浓度10^-7~10^-1下对MCF-7细胞均表现为细胞毒性，最大增殖效应在10^-7相对浓度下也仅有69%.活性炭吸附30 min后，酚类提取物对MCF-7细胞增殖随着吸附时间延长增加的幅度低于15%.这是因为渗滤液为老龄渗滤液，成分比较复杂，水体中某些物质会降低活性炭对酚类物质的吸附能力(Yuasa et al., 2005)，故活性炭对渗滤液中酚去除不理想.渗滤液用活性炭处理时，吸附基本在30~40 min达到平衡，随着吸附时间延长有机物去除量增加减缓(Adhoum et al., 2004; Herbert et al.， 2004).与渗滤液原液相比，经活性炭吸附后的酚类物质的雌激素效应反而增加了.一方面可能是因为活性炭对腐殖酸等物质和金属离子的吸附作用，使得吸附在腐殖酸等物质上的和与金属离子络合的酚类物质被更多的萃取出来；另一方面可能因为吸附去除了部分的酚，酚的同分异构体共同雌激素效 应不同(王淑芝等，2010)，而且不同酚因浓度高低共同作用的雌激素效也不一样(卫立等，2006).因此，IME-Fenton对降低老龄渗滤液中酚类物质的雌激素效应是较好的选择.

图5(Fig.5)

图5 稀释渗滤液经活性炭吸附后酚类提取物对MCF-7细胞增殖的影响 Fig.5 Proliferation effect of diluted phenols extracts from leachate treated by activated carbon on MCF-7

MCF-7细胞的划痕损伤修复实验结果见图 6.图 6中的A、B、C、D分别表示渗滤液原液、IME和IME-Fenton处理后渗滤液提取物在稀释至最大增殖浓度和DMSO样品在浸染划痕后的MCF-7细胞24、48和72 h后的形态，E图则表示A、B、C、D组在0 h 划痕的形态，即划痕两边比较整齐，划痕周边的细胞排列紧密.由图 6 A可看出，在浸染细胞24 h后，划痕整齐的边线消失，边线周边的细胞开始向划痕中央扩散；48 h后，细胞进一步扩散，划痕中细胞距离逐渐缩短；72 h后，划痕基本消失，细胞扩散速度达到最大.图B中细胞的迁移速度在同样浸染时间内低于图A；图C中细胞迁移速度低于图B；而图D中在浸染24、48和72 h后细胞的迁移距离几乎不变.渗滤液经过IME和IME-Fenton处理后，酚类提取物对MCF-7细胞迁移能力的影响呈下降趋势，即酚类物质雌激素效应下降，在浸染72 h后迁移速度达到最大，与前面研究的酚类提取物在浸染MCF-7细胞72 h时对MCF-7细胞增殖达到最大一致；而试剂DMSO对MCF-7细胞的迁移几乎没影响，进一步说明对MCF-7细胞的迁移受酚类提取物的影响.

图6(Fig.6)

图6 A、B、C、D样和对照组在最大增殖浓度时对MCF-7细胞迁移的影响 Fig.6 Migration of A，B，C，D and control on MCF-7 at the largest concentration

1)MCF-7细胞增殖和细胞划痕实验表明，渗滤液经IME-Fenton处理后，其酚类提取物对MCF-7细胞最大增殖率下降了110%，同时也使得MCF-7细胞的迁移速度明显降低，说明IME-Fenton法可以有效降低渗滤液中的酚类物质的毒性.

2)渗滤液经活性炭吸附后酚类提取物对MCF-7细胞增殖最大为69%，表现为细胞毒性，在吸附30 min后增殖变化不大.说明在IME-Fenton过程中活性炭对酚的去除作用较小，且吸附作用主要发生在反应前30 min.

3)渗滤液中酚的浓度为μg · L^-1级，最大稀释10⁷倍后的MCF-7细胞增殖和细胞划痕实验的实际浓度低至10^-15 g · L^-1，在如此低的浓度下仍表现出雌激素效应，可见在渗滤液这种复杂背景中的酚有较强的生态毒性.MCF-7细胞增殖和划痕实验是一种简便、快速、可行的生物毒性和水处理效果的评价方法，有可能成为复杂背景中超低浓度酚类污染物的检测方法.