碳纳米管(Carbon Nanotubes，CNTs)因其独特的性质，如高强度、高韧性、高电导特性和化学惰性，而被广泛地应用于工业领域(Baughman et al.，2002，Mauter et al.，2008).同时，随着CNTs在工业和商业中的大量、广泛使用，其对环境的潜在影响也已经引起了人们的关注(Helland et al.，2007).研究发现，随着纳米材料的广泛应用，其不可避免地会在生产和使用过程中释放到环境中，从而对生态系统和环境产生不可预知的影响(Baughman et al.，2002).因此，纳米材料的环境行为及其毒性效应引起研究人员的高度关注.

在过去几年，相关研究主要探索了CNTs对人、动物和微生物的毒性效应(Porter et al., 2007，Poland et al., 2008，Kang et al., 2008)，而关于其对作为主要粮食作物和世界上超过一半人口食用的水稻(Fresco，2005)的毒性影响尚未引起足够的重视.Stampoulis等(2009)的研究表明，当多壁碳纳米管(MWCNTs)浓度为1000 mg · L^-1时，对南瓜发芽率无影响，但降低了其生物量；相反地，Khodakovskaya等(2009)研究证明，浓度为40 mg · L^-1的多壁碳纳米管(MWCNTs)会加快西红柿种子的发芽并同时增加其生物量.然而，已有的研究多集中在单一浓度CNTs对植物毒性上(Stampoulis et al., 2009，Khodakovskaya et al., 2009)，却少有关于不同浓度CNTs对农作物的影响研究.虽然越来越多的研究证实，碳纳米材料对植物具有不同程度的生物毒性，但研究结果存在争议(Stampoulis et al., 2009，Khodakovskaya et al., 2009).因此，本文以水稻为试材，探究不同浓度单壁碳纳米管材料(SWCNTs)(10、20、40 mg · L^-1)处理对萌发期内水稻的发芽率、根长耐性指数和幼苗生长期内水稻的鲜重、叶绿素和可溶性蛋白的影响，以及单壁碳纳米管材料在水稻根部的累积情况.

供试水稻(Oryza sativa L)为“陵两优211”，购自于袁隆平农业高科技股份有限公司；单壁碳纳米管(SWCNTs)购自于中国科学院成都有机化学有限公司，样品纯度＞99.9%.

称取一定量的MgSO₄、K₂SO₄、Ca(NO₃)₂、KH₂PO₄、KCl、H₃BO₃、MnSO₄、ZnSO₄、CuSO₄、Na₂MoO₄和Fe-Na-EDTA，加入超纯水配成含0.5 mmol · L^-1 Mg²⁺、2.5 mmol · L^-1 Ca²⁺、2.5 mmol · L^-1 K⁺、0.4 μmol · L^-1 Zn²⁺和2.5 mmol · L^-1 Na⁺的标准的Hoagl and 营养液，并通过3 mmol · L^-1 MES缓冲液和适量NaOH溶液调节营养液pH为6.0.

称取一定量的SWCNTs加入到配制好的Hoagl and 营养液中制成10、20和40 mg · L^-1的SWCNTs悬浮液，然后对悬浮液超声分散(100 W，40 kHz)30 min.用H-8100型透射电子显微镜(TEM)表征SWCNTs悬浮液的尺寸和形状，用Zetasizer Nano ZS(Malvem)电位仪测定SWCNTs悬浮液的Zeta电位，用Inspect S50 扫描电镜(SEM)观察SWCNTs表面形状.

挑选大小均匀、颗粒饱满的水稻种子，在10%双氧水浸泡10 min进行消毒，经超纯水冲洗5次后，在超纯水中浸泡活化2 h，再将种子取出，置于铺有滤纸的培养皿(90 mm×15 mm)中，每个培养皿内均匀放20粒种子，加入SWCNTs悬浮液5 mL，放入培养箱中发芽.培养箱温度为25 ℃，相对空气湿度为70%.实验设置3个水平的不同浓度(10、20、40 mg · L^-1)的SWCNTs处理，同时设定1个加入5 mL Hoagl and 营养液的对照组.当芽长超过种子一半时，认为种子完成发芽，每天观察并记录种子发芽数，用毫米刻度尺测量种子根长.平均发芽率每个处理设置3个重复，根长测量持续到第4 d，平均根长每个处理设置3个重复.4 d后把培养皿继续置于PQX-400人工气候培养箱，培养箱内的培养条件为白天光照16 h，温度为(25±1)℃，湿度为70%，光照强度为10000 lx；夜间不进行光照，温度为(18±1)℃，湿度为75%.每隔2 d更换1次SWCNTs悬浮液以降低SWCNTs悬浮液的团聚，培养26 d后测定水稻的鲜重、叶绿素、可溶性蛋白及SWCNTs在水稻根中的分布，每个处理设置3个重复.

4 d后用毫米刻度尺测量种子根长，计算水稻种子的发芽率，发芽率计算公式为：发芽率=正常发芽的种子数/供试的种子数×100%.

30 d生长结束后，取水稻幼苗用超纯水冲洗3次后用吸水纸吸干，称其鲜重.

叶绿素含量测定参照Bruinsma(1961)的方法，取水稻叶片用超纯水冲洗干净、擦干，称取0.5 g水稻叶片，加入少量石英砂后用80%丙酮避光研磨，过滤后的滤液用80%丙酮定容至50 mL，然后采用UV-2550紫外可见分光光度计测定A₆₄₅、A₆₆₃(以80%为空白校正)，依据公式C_T=20.20×A₆₄₅ +8.02×A₆₆₃(叶绿素浓度单位：mg · L^-1)计算叶片中叶绿素含量.

可溶性蛋白质含量测定参照高俊凤(2000)的G-250考马斯亮蓝法.取整株水稻用超纯水冲洗干净、擦干，称取整株水稻0.5 g，剪碎于预冷的研钵中加提取液3 mL，加少量石英砂，在冰浴中快速研磨成匀浆，匀浆倒入离心管中，再用5 mL提取液(分两次)将研钵中匀浆洗入离心管，然后在10000 r · min^-1、4 ℃条件下离心20 min，上清液即为可溶性蛋白质提取液.取上清液0.1 mL分别放入试管中，再加入Tris缓冲液0.9 mL，空白对照管加Tris缓冲液1 mL，然后加入考马斯亮蓝染色液5 mL，摇匀，在595 nm波长处测定吸光度(A)值.根据所测得的样品吸光度值，从标准曲线查出蛋白质含量，计算叶片和根中可溶性蛋白质含量.

取水稻幼苗的根部，在4 ℃条件下用3%戊二醛预固定2 h，取出用磷酸缓冲液冲洗3次，每次间隔10 min；然后用饿酸固定2 h，取出再次用磷酸缓冲液冲洗两次，每次间隔10 min；最后用100%酒精和100%丙酮分别脱水1次，每次10 min.脱水后，用丙酮与包埋剂按照1 ∶ 1比例的混合液浸透1 h以上，在60 ℃条件下固化48 h后，切片，最后水稻根切片置于铜网上用H-8100型透射电子显微镜(TEM)观察.

实验数据以平均数±标准偏差(Mean±SD)来表示，用SPSS统计软件对实验数据进行单因素方差分析，用ANOVA(analysis of variance，LSD检验法)进行显著性差异检验(p＜0.05)，并用Origin 8.0软件绘图.

纳米颗粒对植物的影响因素十分复杂，除了植物自身种类的因素外，还与纳米颗粒的理化性质有密切关系，如化学组成、粒径、形态结构及表面电荷等(Handy et al.，2008，Ju-Nam et al., 2008). 因此，本文对试验所用SWCNTs悬浮液性质进行了表征.SWCNTs在水相中的透射电镜图像和扫描电镜图像如图 1所示.由图 1可知，SWCNTs颗粒呈细管状，SWCNTs悬浮液在水相中产生了一定的团聚.同时由表 1可知，SWCNTs粒径随着浓度的升高而增加，再次说明SWCNTs悬浮液在水相中产生了一定的团聚.

图1(Fig.1)

图1 SWCNTs透射电镜(TEM，a)和扫描电镜(SEM，b)图 Fig.1 TEM(a) and SEM(b)images of SWCNTs used in the present study

表1(Table 1)

表1 单壁碳纳米管颗粒的性质 Table 1 Characteristics of SWCNTs

表1 单壁碳纳米管颗粒的性质 Table 1 Characteristics of SWCNTs SWCNTs材料悬浮物浓度/(mg · L-1) 粒径/nm 纯度 Zeta电位/mV 10 2.4±0.6 ＞99.9% -10.3±1.1 20 3.7±1.2 ＞99.9% -15.6±2.3 40 4.6±2.1 ＞99.9% -19.8±2.6   注：表内数据为平均值±标准偏差.

水稻种子发芽率结果如图 2所示，在SWCNTs处理4 d后，与对照组相比，不同浓度的SWCNTs 处理悬浮液对水稻的最终发芽率没有影响(p<0.05)，但随着其浓度的逐渐增大，水稻种子发芽率达到100%的时间延长.当浓度为10和20 mg · L^-1时，发芽率达到100%的时间是3 d，但当浓度为40 mg · L^-1时，发芽率达到100%的时间是4 d，与10、20 mg · L^-1处理和对照组相比，发芽时间延迟了1 d.水稻根长耐性指数结果如图 3所示，在SWCNTs悬浮液处理4 d后，与对照组相比，水稻根对SWCNTs悬浮液比较敏感，水稻根长耐性指数随着单壁碳纳米管浓度的增加而下降(p<0.05).

图2(Fig.2)

图2 处理4 d后SWCNTs对水稻种子发芽率的影响 Fig.2 Effects of SWCNTs on rice germination rate after 4 days exposure

图3(Fig.3)

图3 处理4 d后SWCNTs对水稻幼苗根耐性指数的影响 Fig.3 Effects of SWCNTs on rice seedlings root length tolerance index after 4 days exposure

实验测量并记录了30 d后水稻幼苗的鲜重(图 4)，结果表明，与对照组相比，SWCNT处理明显降低了水稻幼苗的鲜重，且水稻幼苗鲜重随着浓度的增大呈现明显的降低趋势(p<0.05)，在10、20和40 mg · L^-1SWCNTs处理下，分别下降了14.2%、21.0%和38.8%.

图4(Fig.4)

图4 处理30 d后SWCNTs对水稻幼苗鲜重的影响 Fig.4 Effects of SWCNTs on rice seedlings fresh weight after 30 days exposure

由图 5所示，SWCNTs处理30 d后，与对照组相比，10、20和40 mg · L^-1 SWCNTs处理下的水稻幼苗叶片颜色显著变黄，叶绿素含量(以鲜重计)分别下降了23.3%、28%和39.9%，即SWCNTs浓度越高对叶绿素合成的抑制程度越大.

图5(Fig.5)

图5 处理30 d后SWCNTs对水稻幼苗叶片叶绿素的影响 Fig.5 Effects of SWCNTs on chlorophyll content in leaves of rice seedlings after 30 days exposure

由图 6可以看出，在SWCNTs处理30 d后，与对照组相比，10、20和40 mg · L^-1 SWCNTs处理下，水稻幼苗可溶性蛋白含量(以鲜重计)分别降低了50.9%、55.1%和64.1%.

图6(Fig.6)

图6 处理30 d后SWCNTs对水稻幼苗可溶性蛋白含量的影响 Fig.6 Effects of SWCNTs on soluble protein content of rice seedlings after 30 days exposure

由图 7a和7b可以看出，黑色的SWCNTs吸附团聚在水稻幼苗的根部.由图 7c和7d可以看出，SWCNTs穿透水稻幼苗根尖表皮细胞而镶嵌在水稻根细胞壁中.

图7(Fig.7)

图7 SWCNTs在水稻幼苗根细胞中的透射电镜(TEM)图(a：SWCNTs处理下水稻根，b：a图的局部放大光学显微镜图，c：b图的局部放大透射电镜(TEM)图，d：c图的局部放大透射电镜(TEM)图) Fig.7 TEM images showing the presence of SWCNTs in rice seedlings root cells

在整个4 d的处理时间内，不同浓度的SWCNTs对水稻种子的发芽率没有影响，但会延迟水稻种子的发芽时间(图 2)，抑制水稻根的伸长(图 3).该结果与Canas等(2008)的研究结果相似，他们发现SWCNTs对卷心菜、西红柿、洋葱、黄瓜、胡萝卜和莴苣的发芽率没有任何影响，但抑制了西红柿和莴苣根长.研究发现，具有选择性渗透作用的种子表皮能保护种子胚胎免受外界环境的干扰(Miralles et al., 2012).水分的吸收在种子发芽过程中起着至关重要的作用，因为成熟的种子相对干燥，需要大量的水分满足细胞的新陈代谢和生长(Ma et al., 2010).单壁碳纳米管具有团聚性(图 1)，当水稻种子与SWCNTs接触后，SWCNTs会吸附团聚在种子表皮，随着浓度的增加团聚能力会增强，团聚在种子表皮的SWCNTs有可能会阻碍种子对水分的吸收而不能满足细胞新陈代谢的需要，进而造成水稻种子发芽延迟.纳米材料团聚在植物根表面会降低根部的渗透系数和阻碍水分的利用，进而降低蒸腾作用和影响植物的生长(Asli et al., 2009).当水稻根穿透水稻种子皮的时候，将会失去水稻种皮的保护而直接暴露在SWCNTs悬浮液当中，因此，团聚在水稻根部的SWCNTs有可能会阻碍根部对水分的吸收进而抑制水稻根部的伸长.

Stampoulis等(2009)研究了多壁碳纳米管(MWCNTs)对南瓜生物量的影响，结果表明其明显降低了南瓜生物量；Lin等(2009)研究发现，MWCNTs能够降低拟芥蓝T87中叶绿素和可溶性蛋白质含量，这与本文的研究结果一致.本研究发现，在整个30 d处理时间内，与对照相比，10、20和40 mg · L^-1 SWCNTs处理下的水稻幼苗的鲜重(图 4)、叶绿素含量(图 5)和可溶性蛋白含量(图 6)均降低.在整个30 d处理时间内，SWCNTs穿透水稻幼苗根尖表皮细胞而镶嵌在水稻根细胞壁中(图 7).该结果与Wild等(2009)的研究结果相似，他们研究发现，MWCNTs能够穿透小麦幼苗根细胞.植物细胞壁是纳米材料进入植物细胞内的第一道屏障，植物细胞壁的孔径约为5~20 nm(Fleischer et al., 1999)，因此，小于细胞壁孔的纳米颗粒能比较顺利地穿过细胞壁孔而直接进入植物细胞(Navarro et al., 2008, Moore，2006)，如Liu等(2009)研究发现，水力直径为3.8 nm的SWCNTs能穿透烟草细胞膜和细胞壁.细长的管状的碳纳米材料(CNTs)能够比较容易地进入到细胞内，阻碍细胞对水分和营养元素的吸收(Miralles et al., 2012).在本实验研究中所用实验材料SWCNTs粒径最大为4.6 nm(表 1)，小于植物细胞壁的孔径，这很有可能使SWCNTs比较容易进入到水稻根细胞.吸附团聚在水稻幼根表面和进入水稻幼苗根尖表皮细胞的SWCNTs很有可能阻碍根对水分和营养物质的吸收，导致水稻幼苗叶片变黄，最终导致水稻幼苗中叶绿素和可溶性蛋白合成受阻，影响水稻幼苗的生长.

不同浓度的SWCNTs对水稻种子的发芽率没有任何抑制作用，但随着SWCNTs浓度的提高延迟了发芽率达到100%的时间.水稻幼苗根长随着SWCNTs浓度的提高而减小.水稻鲜重随SWCNTs处理浓度的增大而降低，对水稻生长的抑制程度与SWCNTs处理浓度正相关.水稻叶片颜色随SWCNTs处理浓度的增大而变黄，水稻叶片中叶绿素含量随SWCNTs处理浓度的增大而降低，表明SWCNTs对水稻叶片光合系统产生了伤害.水稻可溶性蛋白含量随SWCNTs处理浓度的增大而降低.通过透射电镜观察发现，SWCNTs颗粒分布在水稻幼苗根尖表皮细胞的细胞壁中.