柴油是土壤和水体中常见的一种污染物，由于其疏水性强，不活泼且难生物降解(Davis et al., 2003)，会在环境中长期滞留，进而危害水体功能和水生生物资源，因此，柴油废水的治理一直是人们关注的焦点(Wentzel et al., 2007).

目前，治理柴油污染的方法主要有物理法、化学法、生物法等(Franzetti et al., 2008; Vieira et al., 2009; Lohi et al., 2008).物理和化学法能够快速去除柴油大部分组分，但成本较高且易引起二次污染(Huang et al., 2013). 而微生物法具有成本低、操作简单和可避免二次污染等优点(Wang et al., 2002)，因此，微生物修复环境中柴油污染具有很大的潜力和优势.

在实际应用过程中，游离菌表现出单位体积内有效降解菌浓度低和抗毒性侵害能力差的特点，严重影响其降解效果(Liu et al.，2009). 固定化技术可克服细胞太小且与水溶液分离困难、易造成二次污染等弊端，具有菌体密度高、反应迅速及菌体流失少等优势，是一种具有巨大应用前景的污染物处理技术(Basaka et al., 2014).

近年来，关于固定化技术在石油烃降解领域的应用受到越来越多的关注.Lin等(2014)将两株降解菌固定在棉纤维上来降解粗油，发现当盐度低于70 g · L^-1时，相比游离菌，固定化菌对原油的去除效果提升了30%.Costa等(2014)利用壳聚糖小球固定化B. pumilus UFPEDA831，发现固定化菌体对碳氢化合物去除效率达90.8%，并且可以回收利用.目前，绝大多数固定化技术研究关注的焦点是降解的影响因素，如pH、盐度和温度等，而关于固定化微生物的对柴油去除机理，即对先利用固定化材料对废水中的柴油进行吸附，然后被固定在载体上的微生物降解的研究鲜见报道.

因此，本试验以课题组前期筛选获得的威尼斯不动杆菌为研究菌种(林加奖，2009)，以廉价易得的改性竹炭作为固定化载体，比较游离菌和固定化菌体对于一定浓度柴油溶液的去除效果，探讨固定化菌吸附协同降解去除柴油的动力学过程，并借助红外光谱(FTIR)、扫描电镜(SEM)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)等表征手段，对比分析降解前后溶液的成分变化，为固定化菌降解柴油的机理研究提供研究基础与理论依据.

供试柴油为商用0^#柴油(密度 0.84 kg · L^-1)，经高压灭菌后，室温下保存使用. 实验所用竹炭购自福州某市场，具体参数如下：比表面积130.5 m² · g^-1，微孔容积0.059 cm³ · g^-1，平均微孔径1.79 nm.

改性竹炭颗粒的制备：先将竹炭颗粒用蒸馏水清洗3次，去除粉尘和残留物，再置于105 ℃烘箱中6 h烘至恒重，过30~40目筛，最后放入600 ℃马福炉中煅烧2 h，冷却后置于干燥器内备用.

菌种为本课题组实验室前期从福建某炼油厂筛选分离的威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)，其最佳降解条件为：温度 30 ℃，氮源(NH₄NO₃)0.1 g · L^-1，pH=7.0.

无机盐培养基：K₂HPO₄ 1 g，KH₂PO₄ 1 g，NH₄NO₃ 1 g，MgSO₄ 0.3 g，CaCl₂ 0.03 g，FeSO₄ 0.005 g，ZnSO₄ 0.002 g，MnSO₄ 0.0002 g，蒸馏水1 L，pH值为7.0.Luria-Bertani(LB)培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L.以上所有培养基均经121 ℃灭菌20 min后使用，微量元素于灭菌前加入.柴油培养基：无机盐培养基，十四烷50 mg · L^-1.

从固体培养基斜面上挑取一环菌落，接种到10 mL新鲜的LB液体培养基，30 ℃培养24 h.再按1%(体积比)的接种量转接到新鲜的LB液体培养基，培养12 h.将培养液转移到50 mL离心管中，6000 r · min^-1离心5 min，弃去上清液，再用无菌水冲洗离心，如此重复3次，加入无菌水调到波长600 nm处OD₆₀₀值为0.7的菌悬液备用.

称取0.5 g改性竹炭颗粒，经高温灭菌后加入到含15 mL无机培养基的50 mL锥形瓶中，再按1.5%体积比加入菌液，于30 ℃、150 r · min^-1恒温振荡箱中培养1 d，直到菌株固定在竹炭颗粒上. 固定化后的竹炭颗粒用无菌水冲洗3次去除表面的游离菌，制得改性竹炭固定化Acinetobacter venetianus(Liu et al.，2012).

将固定化菌体过滤后，加入到50 mL含柴油浓度为100 mg · L^-1的无机盐培养基，放于恒温振荡箱，30 ℃、150 r · min^-1下避光培养，分别在0、12、24、36 、48、60、72、84、96 h时取样测定培养基中柴油的残留量.分别以游离菌和改性竹炭作为对照，每个处理平行3次.

设置3组柴油浓度培养基，分别为80、120、140 mg · L^-1.加入0.5 g固定化菌体，在30 ℃、150 r · min^-1下于恒温振荡箱中避光培养，分别在0、12、24、36、48、60、72、84、96 h取样测定溶液中柴油浓度，每个处理重复3次. 柴油的吸附量(Q)的计算公式如下：

培养基中柴油含量分析步骤如下，向培养基、锥形瓶各加入10 mL正己烷作为萃取剂，手动萃取5 min，静置10 min移取上清液，利用UV-Vis在波长226.5 nm处测定吸光度，外标法定量柴油浓度.

柴油降解产物分析采用气相色谱-质谱联用法，样品的提取按照Vieira等(2007)报道的方法.以正己烷萃取反应前后含柴油的水溶液，振荡5 min，再添加定量的无水硫酸钠充分吸水，最后取适量装瓶测样，分别对反应前后溶液的去除效果进行分析.本研究采用的仪器是GC-MS(Agilent 6890-5975，美国)：DB-5石英毛细管柱(30 m×0. 25 mm×0. 25 μm)；载气为He；流速为1 mL · min^-1；柱温 60 ℃，恒温2 min，以12 ℃ · min^-1升温至300 ℃，恒温5 min；进样口温度250 ℃，检测器温度300 ℃，总运行时间27 min(Morris et al., 2009).

取固定化菌体用无菌水洗涤3次，再使用2.5%戊二醛缓冲溶液(pH=7.2)浸泡0.5 h，用无菌水洗去残余的戊二醛后，加入不同浓度的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%和100%)逐级脱水，每个浓度脱水10 min，放入冷冻干燥器里干燥8 h. 再将制得的样品固定在导电胶上，进行等离子表面喷金. 采用日本Hitachi公司(型号为S-570)的扫描电子显微镜，观察样品表面的形貌与形态(Liu et al., 2012).

含柴油水溶液处理前后的傅里叶变换红外光谱采用美国Thermo Corp公司的Nicolet5700红外光谱仪(波数范围为400~4000 cm^-1，4 cm^-1的光谱分辨率)进行分析，采用KBr法进行制样.

图 1为改性竹炭、固定化菌体与游离菌对柴油的去除情况. 从图中可知，改性竹炭在96 h内对柴油去除率达到22.6%，这表明改性竹炭对柴油具有一定的吸附效果，但吸附能力较弱. 游离菌对柴油去除率在96 h内达到80.50%，此去除过程依靠的是微生物的降解能力. 三者中，固定化菌的处理效率最高，在培养第96 h时对柴油去除率达到86.35%，该去除过程包含了竹炭吸附效果和微生物降解两个途径. 产生这种现象的原因一方面可能是由于改性竹炭具有表面多孔的特性，除了对柴油具有一定的吸附效果外，还为微生物的生长提供了广阔的空间，提高了细菌的密度，促进了细菌对柴油的降解(Liu et al., 2012)；另一方面，柴油中某些烃的组分经过生物降解之后会产生一些对微生物生长产生抑制的产物，这些有毒产物的积累会影响微生物细胞的生长繁殖，生物载体能够有效地屏蔽毒性物质对菌株的恶性侵害，增强其适应性(汪杰等，2010).对于所有处理，降解速率在前24 h内较快，之后开始变缓，这可能是由于随着微生物数量的急剧增长，营养物质被消耗，微生物开始衰亡，且柴油被分解后产生的一些物质也会对其产生毒害作用，使降解率降低(Yamaguchi et al., 1999).

图 1(Fig.1)

图 1 游离菌、改性竹炭、固定化菌在96 h内对柴油的去除效率 Fig.1 Removal efficiency of TPHs by free cells，modified bamboo charcoal and immobilized cells

固定化菌对不同浓度柴油的去除如图 2所示.从图中可以看出，固定化菌对3种不同初始浓度的柴油的去除率随时间的变化趋势基本一致.实验前期由于水中柴油充分，微生物活性高，柴油的降解速率最快，8 h内对3种浓度柴油的去除率超过80%. 随着培养时间延长，柴油作为碳源被大量消耗，培养液中的营养物也逐渐减少，降解菌的生长速率降低. 另外，降解产物的不断积累对细菌的抑制作用也可能是去除率下降的一个影响因素(Wang et al., 2012). 培养96 h后，固定化菌对3种不同浓度的柴油的去除率分别达到84.8%(80 mg · L^-1)、88.8%(120 mg · L^-1)和90.5%(140 mg · L^-1). 固定化菌对初始浓度为140 mg · L^-1的柴油水溶液去除率要高于80 mg · L^-1柴油水溶液，进一步说明固定化菌能够以柴油作为碳源，进而达到降解柴油的目的，同时表明固定化菌对高浓度柴油具有较强的耐受性.

图 2(Fig.2)

图 2 固定化菌在12 h内对不同初始浓度的柴油的降解情况 Fig.2 Removal efficiency of TPHs of different initial concentration by immobilized cells

为了进一步研究固定化菌对不同浓度(80、120、140 mg · L^-1)柴油的去除机理，用伪一级动力学模型(2)(Lin et al., 2013)和伪二级动力学模型(3)(Lin et al., 2013)来拟合固定化菌降解柴油溶液12 h内的吸附-降解动力学，结果如表 1所示.

表 1(Table 1)

表 1 柴油在不同初始浓度下的降解动力学拟合结果 Table 1 Different degradation Kinetic of TPH at differently initial concentration

表 1 柴油在不同初始浓度下的降解动力学拟合结果 Table 1 Different degradation Kinetic of TPH at differently initial concentration 初始浓度/ (mg·L-1) 伪一级动力学模型 伪二级动力学模型 去除量/ (mg·g-1) 方程 k1/min-1 R2 去除量/ (mg·g-1) 方程 k2/ (g·mg-1·min-1) R2 80 3.05 ln(qe-qt)= - 0.2267t+1.116 -0.2267 0.9251 7.01 t/qt= 0.1426t+0.1347 0.1426 0.9997 120 3.41 ln(qe-qt)= - 0.1554t+1.228 -0.1554 0.9666 10.07 t/qt= 0.0993t+0.0572 0.0993 0.9993 140 3.94 ln(qe-qt)= - 0.1088t+1.372 -0.1088 0.8498 11.70 t/qt= 0.0854t+0.0395 0.0854 0.9993

动力学拟合所得相关参数如表 1所示，在所有浓度柴油水溶液中，伪二级动力学模型拟合效果(R² >0.99)好于伪一级动力学模型(R² <0.96). 当柴油的含量分别为80、120和140 mg · L^-1时，其对应的去除速率常数k分别为0.1426、0.0993和0.0854 g · mg^-1 · min^-1，这一结果可以说明柴油的初始含量越高，其去除速率越慢. 根据伪二级模型计算的不同浓度柴油的q_e理论值(7.01、10.07、11.70 mg · g^-1)更接近于实验观测值(6.739、10.304、12.637 mg · g^-1). 结果表明，固定化菌去除柴油更符合伪二级动力学模型，这说明多个过程控制固定化菌体对柴油的去除.改性竹炭表面丰富的官能团和内部微孔的结构，均对柴油吸附有所贡献.在柴油从水相向竹炭迁移的过程中，经历了水膜扩散、竹炭颗粒表面扩散和竹炭内部微孔扩散等多种过程.柴油分子进入改性竹炭载体后，负载在载体内外的微生物将总石油烃作为碳源和能源物质，在体内外酶的作用下将其代谢分解(Wang et al., 2015).

根据上述的吸附-降解动力学结果，提出一个可能的固定化菌吸附协同降解的过程机理，可分为两个阶段：在第一阶段，固定化载体的吸附发挥主要作用，导致柴油的浓度降低；第二阶段，固定化菌降解代谢起主导作用，这些假设将被后续的GC-MS及FTIR等分析手段进一步证实；最后阶段，两个过程的综合作用使溶液里的柴油浓度达到动态平衡.

固定前后的改性竹炭表面的SEM结果如图 3所示. 从图 3a可知，在固定化之前，改性竹炭表面积较大，且凹凸不平，分布着大小不一的微孔. 这种微孔结构能够保证氧气、营养元素的输送及降解底物的排放. 这充分说明改性竹炭是微生物固定化的理想载体，其所具有多孔结构能够为微生物提供足够的生长空间. 此外，微孔结构也可为污染物提供进入载体内部的通道(Wang et al., 2012). 从图 3b可见，在孔状结构中有微生物生长，且分布在改性竹炭载体上的菌落形态并不完全一致，有些细菌团簇在一起，有些则处于分散状态. 由此说明，竹炭固定细菌可能存在两种途径，包括菌体间的物理吸附及细菌与载体间的交联作用(Qiao et al., 2010).

图 3(Fig.3)

图 3 改性竹炭固定化菌前(a)、后(b)的电镜图 Fig.3 SEM of modified bamboo charcoal(a)，immobilized bamboo charcoal(b)

图 4是固定化菌去除柴油水溶液前后的FTIR谱图.由图 4可知，降解前柴油水溶液的红外谱图中，3850~3500 cm^-1范围内存在的3733.9 cm^-1及3454.4 cm^-1吸收峰，这是由强烈的羟基伸缩振动引起的(Swiatkowski et al., 2004). 2970~2840 cm^-1为饱和碳氢化合物的特征峰，系甲基、亚甲基和次甲基的伸缩振动和弯曲振动吸收峰.1572.1 cm^-1处出现的强烈伸缩振动峰为苯环骨架振动产生(Cabal et al., 2009)，1470~1430 cm^-1范围内的1448.6 cm^-1吸收峰为C—CH₃弯曲振动峰，在1250~1150 cm^-1区内出现的1210 cm^-1峰为支链烷烃的C—C骨架振动吸收峰.柴油降解后红外谱图中，在3495~3430 cm^-1出现的3437.2 cm^-1峰为芳香仲胺的伸缩振动峰，2924.4 cm^-1附近的吸收峰为羧酸的特征峰，1410~1310 cm^-1范围内的1407.8 cm^-1峰为酯类及醇类的强烈伸缩振动峰.比较降解前后的柴油水溶液的红外图谱发现，固定化菌体系能够有效地处理柴油中的不同组分，经反应后，代谢产物中有羧酸类、酯类、醇类等物质产生.何良菊等(2004)研究表明，石油类物质在微生物的作用下，中间产物往往以脂肪酸类物质居多. 短链烷烃的亚末端氧化为醇和相应的脂肪酸(Forney et al., 1968);直链烷烃的微生物降解途径以单末端氧化和双末端氧化生成二元羧酸为主(McKenna et al., 1970);发生单末端氧化时，烷烃氧化为相应的醛和脂肪酸；而发生双末端氧化，则是烷烃被转化成二元羧酸(Scheller et al., 1998). 这表明柴油的降解过程中不仅有单末端氧化、次末端氧化，同时还有双末端氧化.

图 4(Fig.4)

图 4 改性竹炭固定化菌前(a)、后(b)的电镜图 Fig.4 FTIR of TPHs solution before(a) and after(b)reaction

为了探究柴油的去除情况，分别对微生物降解前后的柴油水溶液进行GC-MS分析. 图 5分别是柴油、游离菌降解后及固定化菌去除后的GC-MS谱图.从图中可以看出，威尼斯不动杆菌可以高效的降解柴油各种长度的烷烃. 由图 5b可知，经过游离菌降解后，柴油中长链烷烃(C₁₆~C₃₀)几乎完全降解，对C₁₁、C₆、C₈的降解率分别达到83.05%、59.54%、55.48%.烃类的降解主要依赖于微生物的降解能力，又受烃类自身性质所制约.Liu等(2011)认为饱和烃较不饱和烃更易降解，这就使得C₁₆~C₂₄范围内的烷烃具有好的降解性. 从图 5c中可以看出，在反应96 h后，固定化菌较游离菌对柴油的去除更为彻底，柴油内不同组分均得到有效地降解.可能是疏水性固定化载体不仅与底物之间存在着高亲和性，而且为降解菌的生长提供了良好的微环境，促使菌株更容易与底物接触并发生反应，从而加快降解速率(Hou et al., 2013). 柴油中部分烃的降解产物可能对微生物的生长繁殖产生抑制作用，而载体对有毒底物的扩散会产生一定的阻碍作用，使得固定化菌表面的实际毒物浓度降低，进而对细胞有一定的保护作用(Yamaguchi et al., 1999). Morris 等(2009)在对微生物降解后的柴油水溶液进行GC-MS分析时发现，在4 min左右产生了大量的乙酸、酮类、酯类、戊二醇等物质，这一结果与图 5b中色谱峰的结果较为相似.因此，结合FTIR结果我们推测，Acinetobacter venetianus对柴油的降解是单末端氧化、次末端短氧化、双末端氧化等多种氧化途径综合作用的结果.

图 5(Fig.5)

图 5 游离菌和固定化菌降解柴油溶液的GC-MS图(a.柴油溶液空白对照组; b.游离菌降解柴油溶液;c.固定化菌降解后的柴油溶液) Fig.5 GC-MS analysis of degradation of diesel oil by immobilized and free cell(a.Diesel oil extracted from control culture without cell inoculation，b.Diesel oil extracted from a culture of free cells，c.Diesel oil extracted from a culture of immobilized cells)

1)通过研究改性竹炭固定化Acinetobacter venetianus去除水体中的柴油，可知固定化菌对柴油的去除效果高于游离菌，对140 mg · L^-1的柴油水溶液的去除率达到90.5%；而改性竹炭表面多孔的特性对柴油存在一定的吸附作用; 固定化菌对柴油的吸附协同降解过程拟合结果符合伪二级动力学，这表明油类分子首先被改性竹炭吸附，再被威尼斯不动杆菌降解.

2)通过对SEM结果分析，证实改性竹炭能够很好地固定Acinetobacter venetianus.结合FTIR和GC-MS结果推测，柴油经过威尼斯不动杆菌降解之后，部分组分转化为酮类、羧酸类，这表明在固定化菌在去除柴油不同组分的过程中存在着多种降解机制.