N₂O致温效应为CO₂的300多倍、CH₄的4～21倍，估计地球上N₂O排放对全球温室效应的贡献约占5％~6％(IPCC，1996).污水处理厂氮去除过程会产生大量N₂O(Tallec et al., 2006; Kampschreur et al., 2008)，占水处理全过程释放的温室气体(包括CO₂，CH₄和N₂O)总量的26%(Kampschreur et al., 2009).我国城镇污水处理厂2011年N₂O释放总量估计约为1.26×10⁹ g(以N计)(王亚宜等，2014).因此，污水生物脱氮过程中N₂O产生及控制是目前研究的热点之一.

污水生物脱氮过程中硝化及反硝化过程均能产生N₂O(Kampschreur et al., 2009;Wunderlin et al., 2011；刘秀红等，2006)，自养硝化过程N₂O通过AOB硝化菌反硝化或羟胺氧化(化学和生物)产生，其N₂O的产生涉及多种酶参与(见图 1)，羟氨氧化还原酶(Hydroxylamine oxidoreductase，HAO)是在硝化阶段将羟胺转化成亚硝酸盐的氧化还原酶，位于细胞膜外周质中.有研究表明，羟胺在好氧和厌氧条件下均能被HAO氧化(Yamanaka and Sakano et al.，1980)，而N₂O是羟胺氧化的副产物(Otte et al., 1999).可见HAO对N₂O产生起着关键调控作用.

图1(Fig.1)

图1 污水处理硝化过程N2O产生的可能途径及相关酶 (其中：AOB(氨氧化菌，Ammonia-oxidizing bacteria)； AMO(氨单加氧酶，Ammonia mono-oxygenase)：HAO(羟胺氧化还原酶，Hydroxylamine oxidoreductase)；NOR(亚硝酸氧化还原酶，Nitrite oxidoreductase)) Fig.1 Postulated pathway of N2O production and enzymes in nitrification of wastewater treatment

污水生物处理过程中，酶是控制N₂O释放的关键所在(Richardson et al., 2009).目前，一些纯种自养和异养硝化菌的HAO已经分离提纯(Wehrfritz et al., 1993，1996； Kurokawa et al., 1985；Hoppert et al., 1995； Zahn et al., 1994；Ono et al., 1996)，这些HAO分子量和结构有所不同(Arciero and Hooper， 1993；Moir et al., 1996；Jetten et al., 1997a；Shimamura et al., 2008).但目前尚无污水生物处理活性污泥HAO的研究报道，一个原因可能是脱氮污泥中硝化菌种类复杂多样，不利于分离提纯HAO而制约了这方面的研究.

不同研究报道的HAO提取和活性测定方法有所不同，破碎细菌细胞的方法有超声法(Jetten et al., 1997b)、压力破碎法(Otte et al., 1999)，有研究使用高渗裂解液(Zhang et al., 2014)辅助细胞破碎；酶活性测定时以铁氰化钾作为电子受体，但是所使用的电子受供比也有差异，Otte等(Otte et al., 1999)在测定发酵罐中粪产杆菌的HAO时选用电子受供配比1 : 2，而Tateo Yamanaka等(Yamanaka and Sakano et al.，1980)从Nitrosomonas europaea菌提取纯化HAO时表明，电子受体超过4倍的供体羟胺后，羟胺能迅速被氧化成NO₂^-.Mike等(Jetten et al., 1997b)在研究羟胺代谢时采用电子受供配比为5 : 2的反应试液.由此可见，目前尚无确定可行的活性污泥HAO酶提取和活性测定方法.

基于此，本文在前期研究(南亚萍等，2012；刘婧晶等，2014)的基础上，从破碎方法、裂解液的使用、酶活测定液电子受供比、反应终止剂等方面对污水生物处理活性污泥中HAO酶的粗提取及酶活测定方法进行了探索研究，旨在为进一步探索污水生物处理中N₂O产生和控制的酶水平研究奠定基础.

活性污泥取自实验室处理模拟城市生活污水的SBR反应器.该反应器的有效容积为6 L，每天运行3个周期，每周期8 h，包括进水10 min(充水比为1/2)，厌氧搅拌120 min，好氧240 min，沉淀40 min，出水10 min，闲置60 min.人工废水由葡萄糖、乙酸钠、氯化铵、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁和氯化铁配制而成，加入碳酸氢钠调节pH值为6.8～7.8(FE-20型酸度计，梅特勒-托利多(上海)有限公司).COD约为400 mg · L^-1，氨氮约为60 mg · L^-1，总磷约为5 mg · L^-1.

反应器温度维持在25 ℃；污泥浓度维持在MLSS 3255 mg · L^-1(MLVSS/MLSS值在0.80左右).控制曝气强度在0.6 L · min^-1，好氧段DO浓度维持在0.3~0.6 mg · L^-1.

当氨氮去除率达到90%以上并稳定运行时取样.取样时间点选择在每周期曝气开始后0.5 h.

取25 mL泥水混合液，在4000 r · min^-1离心3 min(J-26XP贝克曼高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司生产)，倾去上清液，沉淀用缓冲液(50 mmol · L^-1 Tris-HCl，pH 7.8，5 mmol · L^-1 MgCl₂)定容到25 mL，再次离心3 min，倾去上清液，此步骤重复一次.沉淀备用定容至25 mL后，破碎细胞.4 ℃条件下，40000×g 冷冻离心30 min，上清液于4 ℃条件下贮存备用.

超声法：用BILON92-II超声波细胞粉碎机(上海比朗仪器有限公司)于0 ℃的冰-水混合水浴中破碎细胞，调节输出功率200 W，工作3 s，间歇3 s，破碎次数分别设定为30次、60次、99次.

压力细胞破碎法：在4 ℃条件下用JN-02低温超高压连续细胞破碎仪(广州聚能生物科技有限公司)破碎，设定压力50、110、160 MPa，分别破碎1、2、3次.

超声与裂解液结合法：洗涤后的沉淀加细胞裂解液(50 mmol · L^-1Tris-HCl(pH 7.5)，10%蔗糖，300 mmol · L^-1 NaCl，90 mmol · L^-1 EDTA)2 mL、5 mL、10 mL，10 min后，缓冲液定容至25 mL后进行破碎，方法同超声法.

压力与裂解液结合法：洗涤后的沉淀加细胞裂解液2 mL、5 mL、10 mL，10 min后，缓冲液定容至25 mL后进行破碎，方法同压力细胞破碎法.

用ND-2000微量分光光度计(美国Nanodrop科技有限责任公司)测定破碎后混合液中的DNA含量，将DNA含量高低作为衡量细胞破碎的程度的指标.

(1)酶活力测定原理：根据HAO酶的氧化还原特性，本实验以铁氰化钾为电子受体，以羟胺为电子供体.羟氨氧化还原酶的活性在400 nm处以铁氰化钾的还原量来计算酶活性.

(2)酶活性单位定义：25 ℃，pH 8.0条件下每分钟还原1 μmol K₃Fe(CN)₆的酶量为一个酶单位.按下式计算HAO酶的活性(U · mL^-1)，摩尔吸光系数ε为1 L · mol^-1 · cm^-1.

酶活性:A =400/[ε·b×t]×V_L/V×B 式中，t为时间(min)，V_L为测定液体积(mL)，V为酶液体积(mL)，B为稀释倍数，b为比色血宽度(1 cm).

(3)酶活力测定步骤：取4 mL反应混合液放入试管中，加入适量酶提取液，立即混匀并计时，25 ℃恒温水浴仪(北京市永光明医疗仪器有限公司)中准确保温一定时间；反应完成后立即加入2 mL终止剂终止酶反应.室温放置5 min后，UV-2600A分光光度计(龙尼柯(上海)仪器有限公司)于400 nm处测定吸光度；空白对照管先加入2 mL反应终止剂，再加酶液.

粗酶液中总蛋白质含量测定：Bradford法(Bradford，1976)； DNA含量：微量分光光度法；酶活性测定：分光光度法.

(1)酶反应液电子受体与供体比的选定：选择电子受供比1 : 4、1 : 2、1 : 1、2 : 1、4 : 1，分别取5组平行样.

(2)反应终止剂的选择：选用20%三氯乙酸及2 mol · L^-1 HCl，分别取5组平行样.

多组平行试验结果均以平均值±标准差(±SD)来表示，组间比较采用SPSS13.0 软件进行单因素或多因素方差分析.

HAO为细胞膜外周质酶，能否完全将菌体细胞壁破碎是该酶提取的首要因素.本研究探讨了五种不同的破壁方法，用微量分光光度计测定DNA含量确定破壁效果，同时测定酶活力.

首先对超声法同一功率下超声破碎次数对破碎效果影响进行实验，结果见表 1所示.

表1(Table 1)

表1 超声处理次数对污泥破壁的效果 Table 1 Effect of ultrasonic treatment times on cell disruption

表1 超声处理次数对污泥破壁的效果 Table 1 Effect of ultrasonic treatment times on cell disruption 破碎方法 酶活OD 酶活/(U · mL-1) 蛋白质/(mg · g-1(VSS)) DNA/(mg · g-1(VSS)) 30次(Tris-HCl定容) 0.127±0.007 0.203±0.011* 303±6.24Δ，* 24.9±2.53Δ，* 60次(Tris-HCl定容) 0.132±0.008 0.211±0.013 388.6±7.20 56.3±3.04 99次(Tris-HCl定容) 0.180±0.004 0.288±0.007 491.2±8.25 61.3±4.41 注:Δp＜0.05，与60次组相比；*p＜0.05，与99次组相比. Δp＜0.05，Compared with 60 times group;*p＜0.05，Compared with 99 times group.

从表 1可知，超声破碎次数增加，DNA含量增加，提取的粗蛋白含量增加，HAO酶活增大，说明细胞破碎程度提高.单因素方差分析表明，破碎30次DNA及蛋白质量均明显小于60次和99次(p＜0.05)，但是酶活与60次无明显差异，与99次相比明显偏小(p＜0.05)，为了缩短实验时间及更好的保存酶活性，选择破碎30次进行后续实验.

表 2 是化学渗透对细菌细胞破碎效果的影响.从表 2可知，添加细胞裂解液后，酶活性及DNA比未加的条件下(表 1所示)增加近5倍及多至十几倍.从DNA结果来看，加5 mL和10 mL裂解液没有差异(p>0.05)；酶活和蛋白质5 mL条件均显著小于10 mL及25 mL条件(p＜0.05).但研究过程发现添加10 mL及更多裂解液时，用Br and ford法测定蛋白质容易产生沉淀，在此种情况下，用分光光度计测定蛋白质比较耗时，读数不稳定.

表2(Table 2)

表2 化学渗透处理对污泥破壁的效果 Table 2 Effect of chemical lysis on cell disruption

表2 化学渗透处理对污泥破壁的效果 Table 2 Effect of chemical lysis on cell disruption 破碎方法 酶活OD 酶活/(U · mL-1) 蛋白质/(mg · g-1(VSS)) DNA/(mg · g-1(VSS)) 30次(5 mL裂解液) 0.605±0.012 0.968±0.019Δ，* 346.1±6.57Δ，* 169.0±4.58* 30次(10 mL裂解液) 0.653±0.006 1.045±0.009 543.3±5.99 172.3±6.43 30次(25 mL裂解液) 0.658±0.010 1.053±0.016 1942.4±5.60 441.1±8.79 注:Δp＜0.05，与10 mL组相比；*p＜0.05，与25 mL组相比. Δp＜0.05，Compared with 10 mL group;*p＜0.05，Compared with 25 mL group.

基于上述超声次数和裂解液用量对细胞破碎效果的影响，研究进一步探讨超声、压力及裂解液相互结合对破碎效果的影响，以便找出耗时短、破碎效果好的破碎方法.图 2是不同破碎条件下，破碎次数和裂解液对细胞破碎效果的影响.

图2(Fig.2)

图2 不同破壁条件下，处理次数和裂解液对污泥破碎效果的影响(污泥以mL计) Fig.2 Effects of treating times and lysate on cell disruption using different methods

从图 2可以看出，用细胞破碎仪破碎细胞效果明显比超声破碎细胞效果要好；无论是超声还是细胞破碎仪，加裂解液细胞破碎效果较不加的要好.

对3种压力下的DNA结果经多因素方差分析(0 mL未参与分析)，F_(8，26)=7.281(p＜0.01)，说明压力、破碎次数及裂解液用量均对破碎效果有极其显著的影响.随着细胞破碎仪破碎压力、次数增大，破碎效果增强；2 mL与5 mL裂解液之间破碎效果有显著差异(p＜0.05)，而2 mL与10 mL、5 mL与10 mL裂解液之间之间破碎效果没有显著差异(p>0.05).从图中能看出，160 MPa条件下，加5 mL裂解液破碎3次效果是最好的.

在HAO酶活测定过程中，电子受供比和终止剂的选择对酶活力测定影响较大，因此，本研究进行了电子受供比和终止剂对酶活测定影响的研究.结果如下.

不同微生物菌种、不同的生长环境，HAO的活性高低不尽相同，在以往HAO研究电子受供比1 : 2(Otte et al., 1999)、≥4(Yamanaka and Sakano et al.，1980)、5 : 2(Jetten et al., 1997b)等的基础上，做了表 3所示的电子受供比实验.以确定适合污水脱氮处理工艺HAO酶活研究的配比.取5组试样进行测定.结果见表 3.

表3(Table 3)

表3 不同电子受体与供体比下测定的HAO酶活性 Table 3 HAO activities determined under different ratios of electron donor to receptor

表3 不同电子受体与供体比下测定的HAO酶活性 Table 3 HAO activities determined under different ratios of electron donor to receptor 电子受体A/(mmol · L-1) 电子供体B/(mmol · L-1) A /B 酶活OD值 测后原酶液OD值 1 4 1 : 4 0.128±0.006 0.009±0.002 1 2 1 : 2 0.179±0.007 0.014±0.003 1 1 1 : 1 0.230±0.008 0.850±0.006 2 1 2 : 1 0.133±0.005 1.164±0.005 4 1 4 : 1 0.160±0.005 3.227±0.005

在一定条件下，底物浓度饱和时，酶反应速度与酶浓度呈正比，当底物(不论K₃[Fe(CN)₆]还是NH₂OH)浓度受限时，均会影响酶活性的测定结果.

表 3的结果表明，受供比1 : 4、1 : 2的酶反应液中由于受体K₃[Fe(CN)₆]不足，在短时间内吸光值减小的幅度很大.对测试样品数目较多的过程不适用.而受供比2 : 1、4 : 1条件下，同样反应时间内，受体K₃[Fe(CN)₆]剩余量较多.这4种受供比反应后不太适宜用分光光度计测定，因此宜选用电子受供比1 : 1的酶反应液做酶活性测试，本研究用这一受供比也获得了较其他条件下的最大酶活性(0.368±0.012 U · mL^-1).

当然，这一配比适用于HAO粗酶测定，若是经过纯化后的HAO，适合的受供比需要进行实验来进一步确定.

与加热酶失活方法相比，用酸碱让酶失活更易操作和节省时间，本研究中受体K₃Fe(CN)₆在碱性条件下不稳定，因此实验选取20%三氯乙酸和2 mol · L^-1 HCl作为HAO酶活性反应的终止剂，选用电子受供比1 : 1的酶反应液.取5组试样进行测定.结果见表 4.

表4(Table 4)

表4 反应终止剂对HAO活性测定的影响 Table 4 The effects of different reaction termination reagent on HAO activity

表4 反应终止剂对HAO活性测定的影响 Table 4 The effects of different reaction termination reagent on HAO activity 20%三氯乙酸 2 mol · L-1 HCl OD 酶活/(U · mL-1) OD 酶活/(U · mL-1) 0.209±0.004 0.334±0.007 0.212±0.005 0.339±0.009

从表 4数据可知，20%三氯乙酸与2 mol · L^-1 HCl作为HAO酶反应终止的试剂，酶活测定值经单因素方差分析，无显著性差异(p>0.05).通过测试两者的pH，20%三氯乙酸(pH 1.8)溶液酸性极强，文献(Yamanaka and Sakano et al.，1980; Jetten et al., 1997b; Otte et al., 1999)中采用它作为HAO酶反应终止剂.铁氰化钾遇强酸时产生剧毒的氰化物，从减少环境污染和操作安全的角度，宜选用酸性较弱的2 mol · L^-1 HCl溶液作为反应终止剂.

从图 3可以看出，在不同压力条件下，用细胞破碎仪破碎细胞2次、3次的HAO酶活明显比超声条件下酶活要高；加裂解液破碎后HAO酶活要比不加裂解液的HAO酶活高.

图3(Fig.3)

图3 不同破碎条件下，破碎次数和裂解液对获得的HAO酶测定活性的影响 Fig.3 Effects of treating times and lysate on the activity of crude HAO obtained using different cell disruption methods

对3种压力下的酶活结果经多因素方差分析(0 mL未参与分析)，F_(8，26)=2.718(p＜0.01)，说明压力、破碎次数及裂解液用量均对酶活有极其显著的影响.只看压力变化时，两两压力之间酶活无差异(p>0.05)；破碎2次与1次之间酶活有极其显著差异(p＜0.01)，而破碎2次与3次之间酶活无差异(p>0.05).

在不同的压力条件下，均是加5 mL裂解液的HAO酶活性要高(与10 mL比无差异(p>0.05))，加10 mL裂解液后酶活反而降低，原因可能是细胞裂解液中含有EDTA，而HAO的活性位点由c型亚铁血红素和血红素P460构成(Hooper et al., 1997)，较多的裂解液加入影响了HAO的活性.

从图中看出，160 MPa条件下，加5 mL裂解液破碎细胞2次有最高的HAO酶活力.

酶的比活力(specific activity)也就是酶含量的大小，即每毫克蛋白所具有的酶活力.酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高

从图 4可以看出，超声条件下，酶的比活力比细胞破碎仪破碎细胞酶比活要高；超声条件下，随着裂解液增多，酶比活力有所增大，但是增加幅度很小.

图4(Fig.4)

图4 不同破碎条件下，破碎次数和裂解液对获得的HAO酶的比活力的影响 Fig.4 Effects of treating times and lysate on the specific activity of crude HAO obtained using different cell broken methods

对3种压力下破碎2次、3次的酶比活力结果经多因素方差分析(0 mL未参与分析)，F_(4，17)=16.262(p＜0.01)，说明压力、破碎次数及裂解液用量均对酶比活力有极其显著的影响.不同压力下酶比活力有极其显著差异(p＜0.01)；破碎2次与3次之间酶比活力有极其显著差异(p＜0.01)，压力与次数相同的条件下，不同裂解液用量组间酶比活力无差异(p>0.05).

随着细胞破碎仪破碎压力增大，HAO酶比活力减小，说明压力增大后，细胞破碎效果增强，有更多的蛋白从细胞中溶出，而HAO酶的量则没有随之增加，分析原因可能是瞬间高压产生热量破坏了HAO及其活性.

综上所述，160 MPa条件下，加5 mL裂解液破碎3次效果是最好的，该条件下破碎细胞2次有最高的HAO酶活力，但是从酶比活力看，该条件下破碎2次和3次的酶比活力均比110 MPa加裂解液5 mL破碎2次要低(p＜0.01)，因此综合DNA、酶活力和酶比活力考虑，110 MPa加裂解液5 mL破碎2次更适合污水生物处理中HAO的研究，既节省时间，又能较好的保持酶活性.

1)压力、破碎次数及裂解液用量对脱氮活性污泥粗提液中DNA、HAO酶活力及酶比活力均有极其显著的影响(p＜0.01).

2)无论是超声还是细胞破碎仪破碎细胞，加裂解液破碎效果比不加要好(DNA含量高)，有较高的酶活力(超3~7倍).随着细胞破碎仪破碎压力增大，破碎效果增强，160 MPa条件下，加5 mL裂解液破碎3次效果是最好的.

3)对相同提取条件下提取的粗酶液，酶活反应液电子受体供体之比为1 : 1时，分光光度法可获得较高的酶活力.

4)酶反应终止剂宜选用2 mol · L^-1 HCl溶液.

5)综合DNA含量、酶活力及酶比活力考虑，110 MPa加裂解液5 mL破碎2次更适合污水生物处理中HAO的研究，既节省时间，又能较好的保持酶活性.