农作物秸秆有机质含量高，并且含有作物和微生物所需要的各种营养元素，开发利用秸秆资源可以保持土壤肥力(Chaves et al., 2005;Flie bach et al., 2000;Hadas et al., 2004;Hasegawa et al., 2005).堆肥化是解决农业废弃物循环利用的重要途径，但存在分解慢、时间长、堆肥质量较差等问题.

堆肥生物化学过程的本质是各种微生物通过发酵，对较难降解的纤维素等大分子物质进行分解转化、合成腐殖质和产生植物生长生理活性物质的过程，整个过程属于酶促反应(李国学等，2000;杨玖等，2013;于鑫等，2014). 国内外关于微生物降解剂的研究较多(高云航等，2014)，但酶制剂对秸秆降解的影响目前尚鲜见报道.秸秆中含有丰富的纤维素，而纤维素致密的结构及不易降解的特性，阻碍了堆肥的腐熟.因此，在堆肥中添加外源纤维素酶有利于纤维素的充分降解，加快堆肥的腐熟，提高堆肥产物的品质. 氮元素用于合成细胞原生质，对于堆肥进程有重要的影响，C/N也是影响堆肥进程的主要因素之一. 添加外源蛋白酶可促进蛋白质类物质的分解矿化，对于提高堆肥氮含量有重要意义. 可见，利用外源酶促进秸秆堆肥腐熟具有理论可行性.

虽然酶制剂在食品、饲料、纺织等各个领域有着广泛应用，但未见外源混合酶制剂在堆肥中的应用研究.因此，本研究通过模拟堆肥试验，研究在堆肥化过程中添加外源酶对堆肥腐熟进程的影响，并利用模糊综合评价法对堆肥腐熟程度进行评价，以了解不同外源酶处理的促腐效果，研究结果将为外源酶在堆肥中的应用提供理论依据.

纤维素酶为木霉产纤维素酶，羧甲基纤维素酶活性为1034 U·g^-1(Ghose，1987). 最适作用温度为40~50 ℃，最适pH为4.5~5.5. 供试蛋白酶为AS1.398中性蛋白酶(Bacillus subtilis neutral protease)，活力为58820 U·g^-1. 外源蛋白酶的最适宜pH值是6.5~7.5，最适宜温度是35~45 ℃.

秸秆为稻草秸秆，其有机碳含量为39.3%，全氮含量为 10.5%，全磷含量为3.4%，全钾含量为9.9%，C/N为37.4，纤维素含量为35.2%.

小白菜种子品种为上海青(Brassica chinensis L.).

将稻草剪为5 cm左右的小段，调节含水率为65%(表 1)，置于小桶(高约23 cm，内径约20 cm)内，盖上盖子，略留有缝隙，置于控温培养箱内. 每5 d进行机械翻动以补充氧气，堆肥过程中的温度控制如图 1所示(韩玮等，2014).

表 1(Table 1)

表 1 各组处理的添加酶量 Table 1 Enzyme concentrations of different treatments

表 1 各组处理的添加酶量 Table 1 Enzyme concentrations of different treatments g 处理 外源纤维素酶 外源蛋白酶 秸秆 水分 CK 175 325 C 10 175 325 P 10 175 325 CP 5 5 175 325

图 1(Fig.1)

图 1 控温培养箱的温度控制 Fig.1 Temperature control during the composting process

由于外源纤维素酶和外源蛋白酶在高温下容易失活，为了避免酶制剂被堆肥初期的高温灭活，在堆肥的第20 d时加入外源酶. 各组添加酶量如表 1所示，各处理分别记为CK(对照处理)、C(纤维素酶处理)、P(蛋白酶处理)、CP(纤维素酶+蛋白酶处理). 将酶制剂按质量比1: 10溶于水，喷洒于堆肥上并迅速混匀，每个处理设置3个重复.

在堆肥的第25、30、40、50、60 d时分别取样，在上、中、下共3个部位分别取鲜样共20 g，测定相关指标后于70 ℃烘干保存，用于之后的分析测定.

含水率采用烘干减重法测定；pH值用pH计测定(固液比1: 20)；EC用电导率仪测定(固液比1: 20)；E₄/E₆(堆肥腐殖酸在465和665 nm的吸光度的比值)用分光光度计测定；铵态氮(NH₄⁺-N)用凯氏定氮法测定；硝态氮(NO₃^--N)用紫外分光光度法测定; 全碳含量采用重铬酸钾容量法-外加热法测定；全氮含量采用凯氏定氮法测定(鲍士旦，2000)；纤维素及半纤维素含量由范氏洗涤剂法测定(Van Soest et al., 1968).

生物毒性由发芽指数表征(Xiao et al., 2009; Zucconi et al., 1981)，取固液比1: 20的浸提液8 mL于垫有滤纸的培养皿中，同时设空白对照(蒸馏水)，每个培养皿内放10粒饱满的小白菜种子，放置在30 ℃培养箱中培养48 h，测定发芽率和根长，发芽指数(GI)计算方法为：

本研究均采用SPSS统计软件进行统计分析.采用Duncan′s新复极差法检验.模糊综合评价是指对多种因素所影响的事物或现象进行总的评价(Sheng et al., 2008; 陈贻源，1984). 本研究采用熵权法赋权，利用模糊综合评价法对堆肥腐熟程度进行排序.

第一步，选取评价指标.评估指标为：

共设n个处理，X_mn代表指标U_m各个处理中的不同值：

然后确定评价因素的隶属度函数.根据前人的研究成果，腐熟度参数的隶属度函数有如下几种情况，根据情况分别确定适宜函数.

将各项评价因子实测值代入相应的隶属函数，从而可以得出模糊综合评价矩阵R(R为m×n阶).

第二步，确定权数.本文采用熵权法赋权，熵权法具体方法如下(贾艳红等，2006;李灿等，2013):

最后，得到模糊综合评价的最后结果：

pH值是影响微生物生长的重要因素之一(Lei et al., 2000). 如图 2a所示，与CK相比，蛋白酶处理pH值上升，而纤维素酶处理及纤维素酶+蛋白酶处理使pH值下降.可能是外源蛋白酶的添加促进了氨化作用的进行，吸收更多的H⁺，因此，pH上升;纤维素酶处理及纤维素酶+蛋白酶处理中，可能是堆肥过程中产生的微量有机酸使得pH值下降.各组的pH值基本都保持在7.5~8.5范围内.

图 2(Fig.2)

图 2 不同酶制剂添加情况下堆肥的pH(a)、E4/E6(b)、电导率(c)的变化 Fig.2 pH(a), E4/E6(b),and EC(c) during composting process

堆肥中的可溶性盐是对作物产生毒害作用的重要因素之一，电导率(EC)反映了堆肥浸提液中可溶性盐的含量. 从图 2b可见，各处理之间从大到小依次为P、CP、C、CK.研究证明，根据土壤浸出液的EC与盐分含量和作物生长的关系，作物生长受抑制的限定EC值为0.4×10⁴ μS·cm^-1(鲍士旦，2000). 虽然添加外源酶制剂增加了土壤EC值，但各组样品60 d时的EC值都在该限定值以下，即对作物生长基本无限制，可以排除盐害影响.

E₄/E₆是堆肥腐殖酸在465和665 nm的吸光度的比值，E₄/E₆比值愈低，表明腐殖质的缩合度和芳构化程度愈高. 从堆肥腐殖化作用的本质来看，主要是小分子腐殖酸向着大分子腐殖酸转化，表现在E₄/E₆比值上，即是从大到小的一个变化趋势. 图 2c中显示，4组样品在25~30 d时的E₄/E₆值都呈上升趋势，说明在此阶段随着秸秆成分的降解，有大量小分子腐殖酸产生；30 d以后都开始下降，表明小分子腐殖酸开始转化成大分子腐殖酸，分子量增加，缩合度增大，从而使堆肥得到腐熟. 其中，纤维素酶+蛋白酶处理的堆肥样品在堆肥中后期的E₄/E₆比值低于纤维素酶处理和蛋白酶处理，明显低于CK.可见纤维素酶和蛋白酶都促进了大分子腐殖酸的合成，有利于提高堆肥的腐熟化程度，而纤维素酶+蛋白酶处理的效果更为明显.

在本试验4个处理中，水溶性铵态氮和硝态氮的变化规律相同，但各个处理之间存在显著性差异(p < 0.05)(图 3).堆肥25~30 d之间，添加外源酶的所有处理NH₄⁺-N含量都有大幅下降，30 d后下降趋势减缓，CK则一直保持平缓下降趋势，含量从多到少的顺序保持为P、CP、C、CK. 各组的NO₃^--N含量都有很大提升，其中，添加外源酶处理都明显高于对照，从高到低的顺序为P、CP、C、CK.可见由于外源酶显著加速了秸秆中含氮物质的分解，释放出大量NH₄⁺-N，继而促进了NH₄⁺-N向NO₃^--N转化，增加了堆肥中硝态氮的含量. 尤其是外源蛋白酶对秸秆中含氮物质有着十分强烈的促进作用.

图 3(Fig.3)

图 3 不同酶制剂添加情况下堆肥的铵态氮(a)、硝态氮(b)、碳氮比(c)的变化 Fig.3 NH4+-N (a), NO3--N (b), and C/N (c) during composting process

C/N是最常用于评价腐熟度的参数，理论上C/N在腐熟的堆肥产品中像腐殖质一样约为10，Golueke等(1990)指出腐熟的堆肥C/N值应小于20.由图 3c可见，各组的C/N均有明显下降，在堆肥化的初期，随着温度的升高，堆体内微生物大量繁殖，微生物活性较强，有机质分解剧烈，相对于氮素损失，含碳量下降较快(李国学等，2000)，因此，堆肥的C/N呈下降趋势.到堆肥化的中后期，氮素损失逐渐减小，而有机物的分解速度也逐渐减缓，因此，堆肥的C/N变化趋于稳定，最后稳定在10左右. C/N从小到大为C、CP、P、CK，这说明添加外源纤维素酶和外源蛋白酶对秸秆堆肥腐熟都有促进作用(p < 0.05).

纤维素类物质是影响稻草堆肥进程的一个重要制约因素.由表 2可以看出，所有处理的纤维素和半纤维素含量都随着堆肥发酵的进行而降低，到堆肥结束时纤维素酶处理纤维素含量比CK处理低35.1%，混合酶处理比CK低14.9%，但蛋白酶处理纤维素含量与CK相似(p>0.05). 这说明外源纤维素酶在纤维素类物质的生物降解中发挥了积极的作用，因此，添加外源纤维素酶可以促进堆肥化进程.

表 2(Table 2)

表 2 堆肥过程中纤维素和半纤维含量的变化 Table 2 Cellulose and hemicellulose during composting process

表 2 堆肥过程中纤维素和半纤维含量的变化 Table 2 Cellulose and hemicellulose during composting process 堆肥时间/d 纤维素含量 半纤维素含量 CK C P CP CK C P CP 25 22.33%±0.98% a 18.29%±0.57% c 22.00%±0.30% a 20.00%±0.26% b 12.81%±0.29% a 11.50%±0.67% b 12.72%±0.77% a 12.30±±0.02% ab 30 21.00%±0.51% a 14.90%±0.08% c 20.40%±0.45% a 18.00%±0.16% b 8.70%±0.63% a 6.30%±0.18% c 9.00%±0.52% a 7.30±±0.49% b 40 19.00%±0.28% a 13.16%±0.58% c 19.19%±0.58% a 16.00%±0.80 6.60%±0.55% ab 4.70%±0.17% c 6.90%±0.25% a 6.00±±0.27% b 50 18.00%±0.20% a 12.00%±0.42% c 17.70%±0.33% a 15.50%±0.87% b 5.70%±0.84% a 4.20%±0.93% b 5.90%±0.43% a 5.20±±0.65% ab 60 17.86%±0.59% a 11.59%±0.77% c 17.50%±0.87% a 15.20%±0.73% b 4.60%±0.77% a 3.80%±0.27% a 4.50%±0.60% a 4.00±±1.00% a 注：小写字母表示具有显著性差异( p<0.05).

从表 2中还可以看出，各组处理的半纤维素含量也明显降低，半纤维素是相对容易分解的物质，半纤维素总量的90%以上可在堆肥化过程中被分解. 到堆肥结束时纤维素酶处理半纤维素含量比CK低17.4%，混合酶处理比CK低13.0%，而蛋白酶处理与CK差异不显著(p>0.05). 说明添加外源纤维素酶可以在短期内迅速提高半纤维素的降解速度，而外源蛋白酶对此没有明显效果.

发芽指数是通过测试堆肥浸出液的生物毒性来评价堆肥的腐熟度(Huang et al., 2004)，一般认为，发芽指数大于90%就表明堆肥的腐熟度较高.如图 4所示，各处理发芽指数都超过50%，说明稻草堆肥本身生物毒性较小. 前30 d不同处理的发芽指数都低于100%；随着堆肥的进行，各处理发芽指数均逐渐升高，最终都超过了100%.纤维素酶处理上升最快，其次是纤维素酶+蛋白酶处理、蛋白酶处理，CK最慢. 说明外源酶的添加进一步降低了堆肥的生物毒性，促进堆肥腐熟.

图 4(Fig.4)

图 4 不同酶制剂添加情况下堆肥发芽指数的变化 Fig.4 Germination index during composting process

到堆肥结束时，所有堆肥处理的腐熟程度各不相同，堆肥质量优劣是由诸多因素优劣状况决定的，具体4个处理的优劣难以用一个指标来评价确定(任春晓等，2012; 田赟等，2010; 杨帆等，2012).目前较为认同的堆肥腐熟度的评价方法根据多个指标综合反映堆肥的腐熟状况(史殿龙等，2010). 模糊综合评价可以对多种因素所影响的事物或现象进行总的评价(Sheng et al., 2008; 陈贻源，1984). 本研究利用模糊综合评价方法对堆肥各处理开展多指标的评定以确定堆肥的腐熟度，以科学评价研究不同外源酶处理的促腐效果.

因整个堆肥过程中pH、EC变化不大，且都在堆肥合格范围之内，纤维素及半纤维素含量不属于堆肥腐熟度指标，所以不列入稻草堆肥腐熟程度的评价因子之中，本研究中选取的评价指标为：

确定评价因素的隶属度函数，关系到堆肥腐熟度评价结果的科学性和精确度. 对小者为优的指标，E₄/E₆、NH₄⁺-N、C/N由式(1)进行归一化计算；对大者为优的指标，NO₃^--N、GI由式(2)进行归一化计算.

根据熵权法计算得到本试验中各指标权重如下：

最后，模糊综合评价的结果为B=(0.17CK，0.67C，0.50P，0.70CP).由此得知，纤维素酶+蛋白酶处理堆肥腐熟程度最好，之后依次是纤维素酶处理、蛋白酶处理、CK. 因此，可以得知，纤维素酶和蛋白酶的配合使用可以促进堆肥腐熟，提高稻草堆肥品质，当然单独使用纤维素酶或蛋白酶也对堆肥腐熟起到一定促进作用.

由于堆肥过程中所有复杂的生化反应过程都是在生物酶的催化作用下发生的，酶活性深刻影响堆肥产品的腐熟程度、有机物质的转化(李国学等，2000;张晓倩等，2012).堆肥物料中的有机物只有小部分小分子有机物可以被微生物直接吸收利用，而大部分的有机物是以高聚物的形式存在，只有通过胞外酶将其分解为溶解性有机物质，再渗入到细胞中供微生物代谢利用(时进钢，2007).生物酶可分为胞内酶和胞外酶，胞内酶催化是在细胞内发生的生化反应，而胞外酶是释放在细胞外的酶，通常催化聚合物质的降解，如植物聚合物、纤维素、木质素等降解，使分解后的小分子物质穿透细胞质膜，实现进一步降解(苏峰峰等，2009). 本试验中外源酶的加入正是由于增加了堆肥中的酶活力而促进了稻草堆肥的腐熟进程.

堆肥化的关键步骤是难分解的纤维素类物质的分解，在植物秸秆的结构中，纤维素是秸秆细胞壁的重要组成成分，起着支持和固定植物体的主要功能，难于被生物分解，阻碍了细胞内容物的释放和矿化(Bernabé et al.， 2013;王伟东，2005).纤维素酶对纤维素等物质具有稳定的分解能力，可以分解纤维素，从而瓦解秸秆细胞壁的骨架结构，使得细胞内容物游离出来，增大细胞内容物与土壤微生物的接触面积，从而加速了堆肥腐熟.外源蛋白酶则可以分解秸秆细胞壁上的粗蛋白，在细胞壁上形成通道，使得细胞内容物可以通过细胞壁上的通道游离出来，接触到外界的微生物，并提高铵态氮含量，因此，也促进了堆肥的腐熟.另外，堆肥的C/N比对堆肥进程也有很重要的作用，添加外源蛋白酶加速蛋白质分解，降低C/N，也有利于堆肥的进行.

对于堆肥进程及腐熟度的评价，现在国内外没有统一的指标体系，选取合理的指标及评价方法是进行合理评价的重要条件，对此国内外学者作了大量的研究，主要从C/N比、NH₄⁺-N和NO₃^--N含量、E₄/E₆的变化和种子发芽指数GI的变化等方面进行综合评价(Bernal et al., 2009; Cheng et al., 2013; Hosseini et al., 2013).本研究结果表明，添加外源纤维素酶或蛋白酶都有利于稻草堆肥腐熟，纤维素酶处理主要降低了堆肥的C/N比，提高了发芽指数；蛋白酶处理则主要提高了NH₄⁺-N和NO₃^--N含量；而从E₄/E₆来看，纤维素酶+蛋白酶处理促进了堆肥腐熟，而且纤维素酶+蛋白酶处理的C/N比、NH₄⁺-N和NO₃^--N含量及GI比较接近最优处理；通过模糊综合评价得出纤维素酶+蛋白酶处理为最优处理.

可以推测外源纤维素酶和蛋白酶对于促进稻草堆肥腐熟具有协同作用，更有利秸秆堆肥的进行.外源纤维素酶和外源蛋白酶的协同作用机制可能为：外源纤维素酶促进了秸秆纤维素的降解，破坏了秸秆细胞壁的骨架结构；外源蛋白酶分解堆肥秸秆细胞壁上的粗蛋白，在细胞壁上形成通道，破坏细胞壁结构并提高氮含量，如下所示.

当然，在堆肥原生酶浓度较低时，人为地增加外源酶可能对堆肥起到促进作用. 但当添加酶制剂之后，就要尽量创造适宜酶活性发挥的环境条件，二者结合才可能更好地加速堆肥腐熟(Fante et al., 2012; Bao et al., 2013).

另外，外源酶应用的成本问题是大家所关注的焦点.按本文中混合酶处理的酶制剂添加比例，处理每吨秸秆需纤维素酶和蛋白酶各28.57 kg，按照目前市价，纤维素酶每吨价格约为21000元左右，蛋白酶每吨价格约为13000元左右，因此，每吨秸秆的酶处理费用不到1000元. 当然目前看来，在大田范围内直接应用此种堆肥不太经济，但应用在高端生态有机肥的生产上则比较适宜. 目前，精细有机肥每吨价格可达到2000~7000元不等，如将加酶有机肥用于高利润的园艺作物等，有利于保障环境和农产品安全.另外，随着发酵工艺的发展，酶制剂生产系统的多样化，酶制剂价格在今后很有可能继续降低，在堆肥上将有更广阔的应用前景.

1)同时添加外源纤维素酶和外源蛋白酶对堆肥中纤维素类物质降解及氮素释放都有较强的促进作用，可显著促进腐殖酸的合成，降低堆肥的碳氮比，降低堆肥的生物毒性.

2)根据模糊综合评价，纤维素酶与蛋白酶的配合使用对于促进堆肥腐熟效果最佳.

3)可以推测外源纤维素酶和蛋白酶的应用具有协同作用，更有利于秸秆堆肥的进行. 外源纤维素酶和外源蛋白酶的协同作用机制可能为：外源纤维素酶促进了秸秆纤维素的降解，破坏了秸秆细胞壁的骨架结构；外源蛋白酶则可以分解秸秆细胞壁上的粗蛋白，在细胞壁上形成通道并提高氮含量.