好氧发酵俗称堆肥，其主要作用是微生物在一定条件下将有机固体废弃物中的有机物质分解成为二氧化碳、水及氨气等，并释放能量，最终使有机物质达到腐熟化、稳定化(曾光明等，2006)，是处理有机固体废弃物一种传统而有效的方式.在堆肥过程中，微生物对有机质的降解起到了主导作用，参与该过程的微生物种类很多，包括细菌、真菌、放线菌和酵母菌等(王家玲，2004).

纤维素在有机固废中含量丰富，是堆肥中微生物生命活动的重要碳源，由纤维素酶生物催化作用对其进行分解.β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)是在纤维素分解过程中进行最后一步水解成葡萄糖的限速酶，是一组异质性的水解酶(Alef et al.,1995; Singhania et al.,2013).β-glucosidase广泛存在于各类微生物，且在多种生物催化过程中发挥关键作用.

氨氧化细菌(AOB)是好氧发酵过程中硝化作用重要的功能微生物，其主要作用是将氨氧化成亚硝酸盐，这是硝化作用的第一步，也是生态系统氮循环中的一个限速步骤.然而AOB生长率极低，采用传统实验方法如细菌分离培养很难深入研究，如今随着分子生物学技术的发展，AOB的定性与定量分析都得以实现(董莲华等，2008；Shimaya et al.,2008).氨单加氧酶(ammonia monooxygenase，amoA)是AOB所特有的一种胞内酶，对编码该酶的amoA基因进行定性定量分析被认为是研究AOB种类、数量及活性的一个重要途径.

亚硝酸盐氧化还原酶(Nitrite Oxidoreductase，NXR)是硝化细菌将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的关键酶，并广泛存在于亚硝酸盐氧化细菌(NOB)中(Zeng et al，2012).NXR的催化亚基则分别由nxrA与nxrB基因编码(Poly et al.,2008).相对于AOB，目前对NOB方面的研究并不多，这是由于NOB具有复杂的分类，包括硝化杆菌属(a-proteobacteria)、亚硝化菌属(g-proteobacteria)、硝化刺菌属(d-Proteobacteria)等，很难通过荧光原位杂交(FISH)和聚合酶链式反应(PCR)研究所有这些分类(Maeda et al，2011).因此，对NXR基因表达进行研究对堆肥硝化作用过程的认识有着积极的意义.

因此，本研究利用荧光定量PCR技术，对有机固体废弃物发酵过程中不同通气方式(罐体内嵌式通气和整体式通气)中总细菌16S rDNA、β-glucosidase、氨氧化细菌aomA基因及亚硝酸盐氧化还原酶nxrB1基因进行定量分析，通过对比两种不同通气方式发酵过程中理化参数变化来分析发酵过程中碳氮代谢相关基因在各发酵阶段的表达变化规律，探讨相关微生物间的协同作用关系，以获得启示指导好氧堆肥技术进一步改善与提高.

堆肥原料采用牛粪与甘蔗叶，按比例混合加入到自制发酵罐中进行强制通气好氧发酵.牛粪取自广西大学动物科学学院水牛养殖基地，甘蔗叶取自南宁郊区甘蔗种植地并粉碎处理，牛粪、甘蔗叶、水按质量比4 ∶ 1 ∶ 1均匀混合.发酵容器为外接空气压缩机的圆柱形发酵罐，可调节通气量，并配有温度计测量堆体温度.

发酵罐分为整体式通气与罐体内嵌式通气两种，如图 1所示，整体式通气由罐底进气管向堆体通气，罐体内嵌式通气通过嵌入堆体内部并带有大量小孔的管道对堆体进行通气.发酵每3 d取样进行理化参数测定且于-20 ℃保存一部分样品待后续分子生物学实验分析，整个发酵过程维持33 d.堆肥原料及通气参数如表 1所示.

图 1(Fig. 1)

图 1 堆肥发酵罐及通气方式示意图(a.管道内嵌式通气发酵罐；b. 整体式通气发酵罐) Fig. 1 Schematic diagram of compost tank and aeration modes

表 1(Table 1)

表 1 堆肥初始数据 Table 1 Initial data of composting

表 1 堆肥初始数据 Table 1 Initial data of composting 通气方式 原料 含水率 堆体质量/kg 堆密度/(kg·m-3) 初始C/N 翻堆 通气量 罐体内嵌式通气 牛粪+甘蔗叶 73.72% 15 294.88 26 不翻堆 2.50 L·min-1，2 min/2 h 整体式通气 牛粪+甘蔗叶 74.31% 15 294.88 25 第5、10、18、26 d 3.30 L·min-1，30 min/2 h

堆肥中有机质含量测定采用国家农业部标准NY525-2012有机肥料中的方法，即重铬酸钾容量法进行测定:称取约0.3 g风干样品先后加入50 mL 0.8 mol · L^-1重铬酸钾和50 mL浓硫酸并沸水浴30 min，冷却定容后以0.2 mol · L^-1硫酸亚铁标准溶液进行滴定；铵态氮采用碱式扩散法(郑必昭，2013)进行测定：10 g样品加入100 mL 0.5 mol · L^-1氯化钠振荡提取1 h后抽滤，滤液与氢氧化钠按体积5 ∶ 1加入到碱式扩散皿中，静置24 h后以稀硫酸标准溶液进行滴定；硝态氮采用紫外分光光度法(氨基磺酸法)测定：10 g样品加入50 mL氯化钾溶液振荡提取1 h后抽滤，滤液稀释10倍进行吸光度测定；酸碱度的测定:取1 g样品加入10 mL煮沸除二氧化碳的去离子水搅拌10 min，离心取上清用pH计测定；约5 g样品于105 ℃烘干24 h，以衡重法测定含水率.每项指标均设3个平行进行测定，取平均值.

选取发酵过程中第1、4、7、11、22、33 d样品进行荧光定量PCR实验测定.总DNA采用POWER SOIL试剂盒进行提取，每个样品平行提取3份总DNA混匀后分装保存.1.2%琼脂糖凝胶电泳检验提取效果.首先进行常规PCR实验，分别扩增细菌16S rDNA、β-glucosidase、amoA及nxrB1基因，引物相关信息如表 2所示.

表 2(Table 2)

表 2 目的基因引物序列 Table 2 Information of target genes

表 2 目的基因引物序列 Table 2 Information of target genes 引物 目的基因 目的 片段尺寸/bp Nucleotidic 序列(5′-3′) 文献来源 338f518r 16S rDNA Bacteria 192 CCTACGGGAGGCAGCAGATTACCGCGGCTGCTGG Muyzer et al.,1993 BGH3BFBGH3BR β-glucosidase β-glucosidase Bacteria 370 TTC GGC GAA GAY CCACG CCT TYR WAR CC Li et al.,2013 amoA-1FamoA-2R amoA AOB 491 GGGGTTTCTACTGGTGGTCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC Rotthauwe et al.,1997 nxrB-1FnxrB-1R nxrB1 Nitrobacter sp. 380 ACGTGGAGACCAAGCCGGGCCGTGCTGTTGAYCTCGTTGA Vanparys et al.,2007

将第一轮扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检验扩增效果，选择基因表达量高即条带较亮的扩增产物，以PCR产物纯化试剂盒对其进行纯化回收，并对纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果.以该纯化后产物为DNA模板进行二次常规PCR扩增，重复上述步骤.经过第二次PCR及纯化后的产物使用紫外分光光度计(NanoDrop-2000)进行浓度测定并计算出基因拷贝数，并于-20 ℃保存作为荧光定量PCR实验标准品.

采用绝对定量法进行荧光定量PCR实验，首先绘制标准曲线.以二次纯化回收产物进行10倍梯度稀释作为实验标准品，选取10^-3~10^-9浓度标准品制作标准曲线.20 μL总反应体系包括：SYBR Green I MIX(2×)10 μL，正反向引物各1 μL(10 μmol · L^-1)，DNA模板3 μL(amoA基因扩增中DNA模板4 μL)，超纯水补齐至20 μL.标准品与实验样品同时上机，均设置3个复孔，标准曲线R²均大于0.99.各基因扩增程序如表 3所示.

表 3(Table 3)

表 3 荧光定量PCR扩增程序 Table 3 Fluorescence quantitative PCR amplification program

表 3 荧光定量PCR扩增程序 Table 3 Fluorescence quantitative PCR amplification program 基因目的 预处理 扩增(40 cycles) 16S rDNA 95 ℃预变性3 min 95 ℃变性25 s，58 ℃退火30 s，58 ℃延伸30 s β-GLUCOSIDASE 94 ℃预变性5 min 95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min amoA 95 ℃预变性4 min 95 ℃变性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s nxrB1 95 ℃预变性15 min 95 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s

使用SPSS软件对罐体内嵌式通气与整体式通气中碳氮代谢相关基因拷贝数进行t检验分析以评估两者差异性，p<0.05表示差异性显著，p<0.01表示差异性极显著.

图 2a为罐体内嵌式通气发酵与整体式通气发酵在整个堆肥过程中的温度变化对比图，两者均在第4 d达到各自的最高温度，分别为57.0 ℃和53.4 ℃.受翻堆影响，整体式通气发酵的堆体温度曲线呈现波峰渐弱型，而两种通气方式整体趋势均为先升高后趋于平缓.两种通气方式发酵高温期(高于50 ℃)时间分别维持了7 d和5 d，在此期间有机质大量分解释放热量离不开微生物在其中的作用.罐体内嵌式通气发酵在一定程度上使堆体内部氧气分布均匀，好氧微生物得到很好的繁殖生长以加快堆肥进程从而达到腐熟，但这种通气方式易导致热量的散失，因此，高温期维持的时间并不长.有机质可视为堆体C(碳)含量指标，其在整个堆肥过程中呈下降趋势，说明大量含C的木质素、纤维素等在微生物作用下得以分解.对比可知，C代谢在整体式通气发酵中进行的更为剧烈，到第16 d有机质含量减少了25.17%，而罐体内嵌式通气发酵则减少了16.26%.

图 2(Fig. 2)

图 2 堆肥过程中温度(a)和有机质含量(b)的变化 Fig. 2 Variation of temperature(a) and organic matter content(b)during composting process

氨气挥发是堆肥过程中氮损失的一个重要途径，是由微生物在分解有机氮化物过程中产生氨气所致.由图 3可知，堆肥升温阶段，随着有机氮分解，堆体中铵态氮含量不断累积升高，但在第4 d开始急剧下降，此时正是这两种通气方式堆肥达到最高温度的时间.在高温期铵态氮含量已大幅下降后该数值一直处于较低水平，两种通气方式中铵态氮含量均表现出相同的趋势.氨氧化细菌是将铵态氮转化成亚硝态氮的一类细菌，因此，该菌群在堆肥高温期的活性对促进硝化作用，减少氨气挥发有着重要作用.对比两种通气方式发酵中硝态氮含量变化可知，两者均呈现先下降后上升的趋势，不同的是罐体内嵌式发酵在第13 d硝态氮含量开始明显升高最终达到1099.67 mg · kg^-1(按干基计，下同)，而整体式通气发酵中硝态氮含量则在第22 d开始显著上升并最终达到1143.96 mg · kg^-1.

图 3(Fig. 3)

图 3 堆肥过程铵态氮、硝态氮含量变化 Fig. 3 Variation of nitrogen in ammonium and nitrate contents during composting process

从细菌16S rDNA基因定量结果(图 4a)可知，罐体内嵌式通气与整体式通气发酵堆体中细菌总数呈先升高后下降趋势，两者均在第4 d达到最大值.结合温度曲线变化图可知，第4 d处于堆肥过程高温期，也是堆体达到最高温的时间，表明细菌菌群在堆肥升温期大量繁殖积累，代谢活动剧烈进行并释放热量.当细菌总量积累到一定程度时，其代谢原料将会出现短缺，高温也让部分细菌失去活性从而使代谢活动剧烈程度下降，温度随之下降.张嘉超等(2010)的研究表明，堆体温度对细菌群落变化影响极其显著.从荧光定量实验结果分析可知，堆体温度对细菌总量变化影响显著，罐体内嵌式通气发酵细菌总量在整个堆肥过程中均大于整体式通气发酵且差异显著(p<0.05)，说明堆体中氧气分布不同会造成影响细菌总量变化的不同.

图 4(Fig. 4)

图 4 细菌16S rDNA(a)、β-glucosidase(b)、细菌amoA(c)和nxrB1(d)基因拷贝数变化 Fig. 4 Variation of 16S rDNA(a)，β-glucosidase(b)，bacteria amoA(c) and nxrB1(d)gene copy number

β-glucosidase作为纤维素分解过程中的限速酶，其含量多少直接反应堆肥中碳代谢进行的剧烈程度.罐体内嵌式通气与整体式通气发酵中β-glucosidase基因拷贝数分别在堆肥第7 d与第4 d达到最大值(图 4b)，该数值分别是堆肥第1 d的4.0倍和6.2倍，而且均处于发酵高温时期，表明碳代谢微生物繁殖速度快并耐高温.结合有机质含量变化曲线图 2b可知.大量碳代谢微生物增加促使有机质含量大幅下降，发生强烈的生物降解作用，整体式通气发酵中碳代谢生物降解作用的剧烈程度大于罐体内嵌式通气发酵.t检验结果表明，两种通气方式堆肥中β-glucosidase基因拷贝数差异性显著(p<0.05).

两种通气方式发酵第1、4、7、13 d未列出AOB含量数据原因是荧光定量PCR实验中无特异性扩增结果，即样品中AOB含量低于检测下限.而在堆肥腐熟期，两堆体中AOB数量均急剧上升，罐体内嵌式通气发酵第33 d AOB含量是第22 d的6.0倍，该数值在整体式通气发酵中是8.5倍.两种通气方式AOB数量均在堆肥后期才出现增长，这与大多数研究结果一致.Zeng等(2012)研究表明，这并非由于AOB生长缓慢所致;Verhagen等(1991)认为，在堆肥中前期有机质降解过程中，身为自养微生物的AOB在摄取营养成分过程中无法与异养微生物相比而被抑制.本实验中罐体内嵌式通气使堆体中氧气分布均匀，也在一定程度上减少了生物膜(Okabe et al.,2004)的形成.然而数据表明，AOB数量变化趋势与整体式通气方式相差不大，说明AOB也并非由于堆体内部缺少氧气而在堆肥后期才出现增长.目前对于造成这一现象原因的解释众多，也并未统一看法，因而找出AOB在堆肥后期增长的根本原因并提高堆肥高温阶段AOB含量将是减少堆肥氮损失、提高堆肥效果的一个重要研究方向.

从硝态氮含量变化曲线(图 3)中可知，两种通气方式在高温阶段的硝态氮含量均下降.硝化细菌属于嗜温菌，被认为对温度极其敏感，超过40 ℃将严重抑制其生长(逯延军等，2008).从荧光定量实验nxrB1基因拷贝数变化图 4可知，两种通气方式发酵中该数值都在升温期较初始值都有所增长，第7 d降到比初始值更低的水平，表明受温度影响硝化作用在高温阶段被严重阻碍.罐体内嵌式通气发酵第13 d nxrB1基因拷贝数达到最大值，此时正是该堆体温度下降进入腐熟期的时候，硝态氮含量也由此急剧上升，氮代谢活动进行剧烈.而整体式通气也在nxrB1基因拷贝数达到最大值的第22 d，硝态氮含量开始急剧上升.t检验结果表明，两种通气方式堆肥中nxrB1基因拷贝数差异性显著(p<0.05).两种通气方式中nxrB1基因拷贝数并未滞后于AOB反而都优先于AOB出现大幅增长，AOB在硝化作用中的限速作用并未在本实验结果中得以体现.对比可知，罐体内嵌式通气发酵高温阶段时间短但硝化作用中亚硝态氮氧化成硝态氮先发生于整体式通气发酵，硝化细菌均发生强烈的氮代谢活动，至发酵终点两者硝态氮含量相差不大.

本研究堆肥原料中甘蔗叶含碳量极高，与高含氮量的牛粪混合后形成碳氮比适宜的堆肥原料，保证碳氮代谢微生物有充足的碳源、氮源营养物质及适宜的生存环境.结合整个实验碳氮代谢相关基因定量结果与理化参数变化可知，在堆肥过程中，碳氮代谢微生物不断利用碳源、氮源物质生长繁殖，协同降解堆体中的有机物质；而碳代谢与氮代谢在一定程度上呈现出“此消彼长”的趋势.在堆肥升温阶段与高温阶段中，碳代谢作用强烈，碳代谢微生物快速生长繁殖，生物降解作用强烈进行；到堆肥腐熟阶段氮代谢作用明显加强，氮代谢微生物大量繁殖，促进硝化作用剧烈进行.因此，根据这个差异性可以把堆肥过程简单的分为碳代谢阶段与氮代谢阶段，碳代谢阶段以降解有机碳，释放热量使堆肥进入高温环境中为主，氮代谢阶段则以降解有机氮，不断促进堆肥腐熟为主.

1)强制通气好氧发酵中，罐体内嵌式通气发酵堆体细菌总量大于整体式通气发酵，说明不同的通气方式发酵影响堆体细菌生长繁殖，导致细菌总量差异.

2)β-glucosidase基因拷贝数在升温期与高温期大幅增加，说明发酵过程中发生强烈的碳代谢生物降解作用，整体式通气发酵碳代谢生物降解作用大于罐体内嵌式通气.

3)AOB在强制通气好氧发酵的高温阶段含量极少，直至腐熟期才大量生长繁殖，导致发酵高温阶段铵态氮大量转化为氨气，造成氮损失.提高高温阶段AOB含量将是减少堆肥氮损失的一个重要研究方向.另外，nxrB1基因在堆肥升温阶段与高温阶段没有大量表达，说明在这两个阶段硝化作用较弱.