2，2-双(4-羟基苯基)丙烷，又称为双酚A(Bisphenol A，BPA)，是一种重要的化工原料，每年有超过800万t的双酚A被用于生产聚碳酸酯和环氧树脂等高分子材料(Hajszan et al.,2010)，可制成茶具、饮用水桶、婴儿奶瓶、食品包装的内涂层及牙齿封闭剂等.在聚合不完全或温度较高的情况下，BPA便会从这些材料中释放，污染环境.目前的研究显示，BPA在大气粉尘、地下水和海水中都有分布(Vandenberg et al.,2007; Zalko et al.,2011)，双酚A暴露与成年糖尿病、心脑血管疾病、免疫疾病都有一定的关系(Rubin，2011; Melzer et al.,2010;Yang et al.,2009; Vandenberg et al.,2009)，其对生殖系统的毒性已为学术界所公认(Braun et al.,2011).

免疫系统是机体抵御外界物质侵袭的第一道防线，环境中的有毒化合物不仅能够引起急性中毒和慢性危害，而且能影响机体的免疫应答，导致免疫功能失调或病理反应.近年来的研究也表明，BPA可造成免疫器官损伤(苗颂等，2009;吕毅等，2006)，但其引起免疫损伤的分子机制并不清楚.因此，本研究将以BPA暴露的小鼠为模型，通过检测其免疫功能相关指标的改变，试图阐明双酚A长期暴露对小鼠免疫功能的影响及可能机制.

仪器：JA2004N型电子天平(上海精密科学仪器公司)，微量移液器(北京大龙公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，高速冷冻离心机(美国Thermo公司)，超净工作台(苏州净化公司)，AU640全自动生化仪(日本Olympus公司)，流式细胞仪(美国Beckman公司)，318MC酶标仪(上海三科公司).

试剂：双酚A(国药集团)，RPMI1640培养基(美国Thermo公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，MTT、刀豆蛋白A(ConA)(美国Sigma公司)，流式抗体CD3-FITC、CD4-PE、CD8a-PE-Cy7、CD49b-APC及Isotype Control APC(eBioscience公司)，NH₄Cl、NaHCO₃、EDTA(国药集团)，YAC-1细胞株(中国科学院细胞库).

昆明种健康小鼠24只，体重约18~22 g，雌雄各半，购自安徽医科大学动物养殖中心.小鼠饲养于标准动物房内(温度20~22 ℃、湿度65%~75%).实验前饲养7 d适应环境，自然光照，动物自由饮水、饮食.

适应性饲养结束后，将小鼠随机分为3个染毒组和1个未处理对照组，每组6只.染毒剂量分别为240、480及960 mg · kg^-1，未处理对照组以溶剂玉米油进行灌胃染毒，每天1次，连续21 d.

小鼠末次染毒后1 h，眼静脉取血，3000 r · min^-1离心10min，小心吸出血清，全自动生化仪上进行检测.

染毒结束后，小鼠脱颈椎处死，立即解剖，取其肝、肾、脾和胸腺组织，生理盐水洗涤两次，滤纸吸干后称重，按公式C=(m₁/m₂)×100%计算脏器系数，其中，C为脏器系数，m₁为器官湿重，m₂为小鼠体重.

取小鼠新鲜脾脏和胸腺，10%甲醛固定，不同梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察其形态学变化.

末次染毒结束后，各组小鼠无菌取脾，按文献方法(Liu et al.,2011)制备脾细胞悬液，用1640培养液调整细胞密度为1×10⁶ cell · mL^-1.将100 μL脾细胞液与100 μL ConA(10 μg · mL^-1)加入96孔板中，37 ℃、5% CO₂培养箱内培养44 h后，加入10 μL MTT，继续培养4 h.培养结束时，在酶标仪578 nm处检测96孔板每孔OD值.按公式SI=OD_st-OD_ck计算淋巴细胞刺激指数，其中，SI为淋巴细胞刺激指数，OD_st为刺激孔的OD值，OD_ck为对照孔的OD值，以SI作为淋巴细胞转化率的指标.

取100 μL小鼠脾细胞悬液于流式管内，分别按照说明书的要求加入3种抗体CD3-FITC、CD4-PE和CD8a-PE-Cy7，于流式细胞仪上检测CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺的比例(Hao et al.,2013).

取样、操作步骤同2.4.5节，向流式管内加入抗体CD49b-APC及Isotype Control APC，于流式细胞仪上检测NK细胞的数量.

将脾细胞(1×10⁶ cell · mL^-1)、YAC-1细胞(1×10⁵ cell · mL^-1)各100 μL置于96孔板中，按Tian等(2003)描述的方法，于37 ℃、5% CO₂的培养箱中孵育20 h，各孔均加入10 μL 5 mg · mL^-1的MTT，继续孵育4 h后，弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，在酶标仪578 nm处检测各孔OD值，并按公式A=(1-(OD_exp-OD_eff)/OD_TC)×100%计算NK细胞的活性，其中，A为NK细胞的活性，OD_exp、OD_eff、OD_TC分别为实验组、效应细胞组、靶细胞组OD值.

采用SPSS 17.0统计分析软件，在p=0.05的置信水平对检测指标进行独立样本t检验(Student′s t-test)，并用Origin 8.0软件绘图(在以下各柱形图中，*，**分别表示与对照组相比，p<0.05，p<0.01).

小鼠染毒3周后，血清中免疫球蛋白指标变化见表 1.与未处理对照组相比，随着BPA染毒剂量的增加，实验组小鼠血清中的IgG及IgM逐渐降低，当剂量为960 mg · kg^-1时，IgG及IgM水平明显降低.

表 1(Table 1)

表 1 BPA对小鼠血清免疫球蛋白的影响(n=6，x±S) Table 1 Effects of BPA on serum immunoglobulin in mice(n=6，x±S)

表 1 BPA对小鼠血清免疫球蛋白的影响(n=6，x±S) Table 1 Effects of BPA on serum immunoglobulin in mice(n=6，x±S) 组别 剂量/(mg·kg-1) Ig G水平 Ig M水平 对照 0 0.115±0.027 0.123±0.035 BPA 240 0.104±0.041 0.098±0.046 480 0.087±0.039 0.075±0.037 960 0.035±0.009* 0.041±0.012*

小鼠染毒后，其处死前体重与实验前体重相比，无统计学差异.染毒21 d后，与未处理对照组相比，其肝脏、脾脏湿重增加，肝脏系数在剂量为480 mg · kg^-1和960 mg · kg^-1时显著增大，脾脏系数在480 mg · kg^-1时明显增大，而胸腺系数则随着染毒剂量的增大而减小(p<0.01)(表 2).

表 2(Table 2)

表 2 BPA对小鼠体重及脏器系数的影响(n=6，x±S) Table 2 Effects of BPA on body weight of mice and their organ coefficients(n=6，x±S)

表 2 BPA对小鼠体重及脏器系数的影响(n=6，x±S) Table 2 Effects of BPA on body weight of mice and their organ coefficients(n=6，x±S) BPA剂量/(mg·kg-1) 体重/g 系数 实验前 处死前 肝脏 肾脏 胸腺 脾脏 0 26.21±2.53 31.25±2.71 0.051±0.003 0.012±0.004 0.0030±0.0005 0.0042±0.0009 240 26.99±4.06 28.79±2.91 0.061±0.010 0.006±0.001** 0.0019±0.0005* 0.0046±0.0010 480 27.19±4.23 31.18±4.53 0.071±0.009** 0.008±0.002* 0.0014±0.0004** 0.0064±0.0002* 960 26.56±4.14 28.97±5.29 0.076±0.008** 0.015±0.004 0.0018±0.0005** 0.0058±0.0007

HE染色后，显微镜下观察小鼠脾脏和胸腺切片.正常组小鼠的胸腺和脾脏组织染色均匀，形态结构正常：胸腺皮质内可见大量核圆、染色深的胸腺细胞即T淋巴细胞前身，髓质内胸腺小体清晰；脾脏红髓、白髓结构清晰(图 1a、e).小鼠染毒后，其胸腺上皮细胞减少，皮质萎缩，胸腺小体出现变性或崩解(图 1b、c、d)；脾细胞充血水肿，脾脏的白髓缩小，红髓扩大(图 1f、g、h).

图 1(Fig. 1)

图 1 小鼠胸腺和脾脏病理切片(HE 染色，100×)(胸腺(a~d)：a.正常小鼠，b~d分别为240、480和960 mg · kg-1 BPA染毒组小鼠；脾脏(e~h)：e.正常小鼠，f~h 分别为240、480和960 mg · kg-1染毒组小鼠) Fig. 1 Histological sections of spleen and thymus in mice(HE staining，100×)(thymus(a~d)：a. normal mice，b~d exposed to BPA at 240、480 and 960 mg · kg-1 respectively; spleen(e~h): e. normal mice，f~h exposed to BPA at 240、480 and 960 mg · kg-1 respectively)

如图 2 所示，与未处理对照组相比，随着染毒剂量的增加，小鼠脾淋巴细胞增殖能力显著升高.

图 2(Fig. 2)

图 2 BPA对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 Fig. 2 Effects of BPA on spleen lymphocyte proliferation of mice

流式细胞仪检测结果显示，小鼠染毒21 d后，脾脏T淋巴细胞亚群发生了变化.与未处理对照组相比，染毒小鼠脾脏CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺细胞的比例明显升高(p<0.05或p<0.01)(图 3、图 4).

图 3(Fig. 3)

图 3 BPA对小鼠脾淋巴细胞亚群CD3+CD4+和CD3+CD8+的影响 Fig. 3 Effects of BPA on splenocyte subsets CD3+CD4+ and CD3+CD8+ in mice

图 4(Fig. 4)

图 4 脾脏CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞的流式细胞仪检测结果(a.正常对照组; b，c，d分别为240、480和960 mg · kg-1 BPA染毒组) Fig. 4 Flow cytometric analysis results of CD3+CD4+ and CD3+CD8+cells in spleen(a. control group; b，c，d are exposed to BPA at 240，480 and 960 mg · kg-1 respectively)

由图 5a可见，与未处理对照组相比，各染毒组小鼠脾脏内NK细胞的数量略有增加，但无统计学意义.NK细胞对靶细胞的杀伤能力则随着剂量的增加而显著降低(p<0.01)(图 5b).

图 5(Fig. 5)

图 5 BPA对小鼠NK细胞数量(a)和活性(b)的影响 Fig. 5 Effects of BPA on number(a) and activity(b)of NK cell

双酚A是一种威胁人类健康的环境雌激素，其毒性研究受到广泛关注，但有关其免疫毒性的研究较少.机体的免疫系统由免疫细胞、免疫器官及各种细胞因子所组成，它们形成一个复杂网络，共同完成机体的免疫应答.动物染毒后，受损脏器重量发生改变，脏器系数也随之改变.在本实验中，BPA染毒后，小鼠肝脏系数、脾脏系数在480 mg · kg^-1组明显增加，而胸腺系数在各剂量组均明显降低，表明BPA对小鼠免疫器官具有毒性作用.病理组织切片显示，BPA可导致胸腺皮质萎缩，皮质/髓质比例下降；脾脏的白髓缩小，红髓扩大，且白髓内的生发中心萎缩，以上病变在剂量为 480 mg · kg^-1和960 mg · kg^-1时表现更为明显，说明BPA 可损伤小鼠的免疫器官，表明其对小鼠免疫系统具有毒性作用.

机体的淋巴细胞主要包括T细胞、B细胞和NK细胞.T、B淋巴细胞均有特异性抗原受体，接受抗原刺激后能发生活化、增殖和分化，产生特异性免疫应答.

当机体受到抗原刺激时，B细胞分化为浆细胞，并分泌抗体，参与体液免疫.因此，B 细胞产生抗体的能力反映了机体的体液免疫功能，可通过检测血清中抗体水平来体现.免疫球蛋白IgG是机体免疫应答中最早出现的抗体，有先锋免疫作用；IgM 是机体再次免疫应答的主要抗体.IgG和IgM均可激活补体、中和细菌外毒素和病毒，在抗感染免疫中起着重要作用.本实验中，染毒小鼠血清中IgG和IgM水平随着染毒剂量的增加而下降，尤以960 mg · kg^-1组最为显著.可见BPA染毒后，可抑制小鼠B细胞分泌抗体，影响其体液免疫功能.

T淋巴细胞在细胞免疫中居中心地位(Winter et al.,2007)，其增殖转化能力反映机体细胞免疫功能的强弱.T细胞表面有许多重要的膜分子，成熟的T细胞一般只表达CD4或CD8分子，它们分别与MHCII类和I类分子结合，可增强T细胞与抗原提呈细胞或靶细胞之间的相互作用并辅助TCR识别抗原.CD4⁺T细胞主要与细胞免疫及B细胞增殖有关，CD8⁺T细胞可杀伤被感染的细胞及肿瘤细胞.研究表明，当T细胞亚群比例(CD4⁺/CD8⁺)失衡或免疫系统被激活时，可引起机体病变(Hussein et al.,2008; Mu et al.,2009).CD4⁺T细胞增多可导致大量炎症细胞因子的释放，形成炎性损伤；而CD8⁺T细胞数量增加可造成重型肝炎患者体内大量肝细胞坏死(林兰等，2009)，由此可见，T淋巴细胞亚群之间的动态平衡对维持机体正常的生理功能十分重要.本实验采用MTT 法检测T淋巴细胞增殖活性，结果发现：随着BPA剂量的增加，小鼠脾脏T细胞的SI值增大；流式细胞仪的检测结果进一步显示：小鼠BPA染毒后，其脾脏CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的比例均显著上升，与Yoshino小组的实验结果一致(Yoshino et al.,2004)，说明BPA可促进脾脏T细胞的增殖，上调小鼠T细胞亚群比例，增强小鼠的细胞免疫功能.

NK 细胞是一类非特异免疫杀伤细胞，是先天性及获得性免疫系统中不可或缺的调节成分.近期研究认为，NK细胞不仅能强化CD4⁺T细胞的功能，促进Th1细胞分化，还能辅助抗原特异性的Tc细胞，并对其他免疫细胞起负调控作用(Zhang et al.,2006; Andoniou et al.,2008; Cooper et al.,2004; Moretta，2002; Deniz et al.,2008)，从而维持免疫系统的动态平衡.NK细胞在抵抗外来侵害和自身免疫性疾病等方面都起着重要的作用.本实验发现，小鼠染毒后，体内NK细胞数量虽略有增加，但其对靶细胞的杀伤能力则显著降低，并呈剂量依赖关系，说明NK细胞活性的降低并非由细胞数量减少而引起，可能是由于细胞的功能受损导致，提示BPA 对小鼠的非特异性免疫功能有一定的损伤.

本研究从体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫等方面检测了BPA 对小鼠免疫功能的影响，结果表明，BPA 可以改变染毒小鼠免疫器官的重量，引起免疫器官产生病理改变，导致小鼠免疫功能紊乱，为今后进一步研究BPA免疫毒性的分子机制提供了实验基础和科学依据.