2015, Vol. 35
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2. 国家海洋局近岸海域生态环境重点实验室, 大连 116023;
3. 大连海洋大学水产与生命学院, 大连 116023;
4. 大连理工大学生命科学与技术学院, 大连 116024
, FAN Jingfeng1, 2
, MING Hongxia1, 2, GUO Jianli1, 4, WANG Yue1, 3, CHANG Yongkai1, 3, GUO Hao1, 2 2. Key Laboratory of Coastal Ecology and Environment of State Oceanic Administration, Dalian 116023;
3. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023;
4. Dalian University of Technology, School of Life Science and Biotechnology, Dalian 116024
辽河口位于辽河三角洲的最南端，盘锦市境内双台子河的入海口处，是由辽河、双台子河、大凌河等一系列河流作用形成的冲海积平原，总面积8万公顷.据统计，每年进入海洋的陆源物质约有85%通过河流进入海洋(陈吉余和陈沈良，2002)，河口是陆源淡水进入海洋的重要区域，汇集了进入海洋的淡水带来大量的陆地有机物和无机营养物质，同时伴随着与人类、动物粪便有关的各种病原微生物，给海产品安全和娱乐用水安全带来巨大的潜在风险(满江红等，2012).由于水体中微生物种类日益多样化，检测水体中所有病原微生物不但工作量大，而且成本高，因此，应该通过检测水体中指示微生物来对水体质量进行评价(张一波等，2009；穆贵强等，2012).然而，在我国现有的海洋生态环境监测方案中，主要通过分析化学需氧量、溶解无机氮、活性磷酸盐、重金属等指标来反映化学污染状况，并没有针对河口这一特殊生境的粪便污染指示微生物相关研究.因此，选取合适的指示菌来评价陆源粪便污染对河口生态环境的影响，并以此为基础开展有效的水质环境监测和管理是非常必要和迫切的.
自20世纪80年代以来，越来越多的研究发现总大肠菌群(Total coliform，TC)、粪大肠菌群(Fecal coliform，FC)和肠球菌(Enterococcus，ENT)与人类健康密切相关，TC、FC和ENT作为水质等级划分的重要微生物指标在国内外被广泛应用(饶利华等，2006；孙傅等，2012；Dechesne and Soyeux， 2006).1914年美国公共卫生署(u.s. Public Health servies)最早提出采用TC作为饮用水受到粪便污染的指示微生物(Stevenson，1953)，此后加拿大、欧盟和澳大利亚也都陆续将TC、FC和ENT作为评价海水浴场水质的重要参考指标.后期研究发现，用大肠埃希菌和肠球菌作为粪便污染指示细菌可能更有指导意义，其中大肠埃希氏菌被用于评价淡水用水的健康风险，ENT被美国广泛应用于监测海洋环境和娱乐水体的健康风险(Bartra and Rees， 2000)，2010年该指标被列入海水浴场微生物水质评价指示菌(中华人民共和国海洋行业标准，2010)，2013年被纳入海洋生态调查指标之列(中华人民共和国海洋行业标准，2013).研究表明，通过分析指示菌与营养盐的相关性还可以判断粪便的污染来源.Talya Bergstein-ben Dan和Fidi Koppel研究了以色列加利利海河口粪便污染指示菌的分布和变化情况(Bergstein-Ben et al., 1997)；1991年至1998年，王文琪等对胶州湾进行了每年4个季度、10个常规监测站的大肠菌群数量调查(王文琪和钱振儒，2000)，通过分析其数量与营养盐的关系，推测出大肠菌群的来源主要是陆源(杨克敌和杨克敌，2007)；龙文芳等分析了FC和ENT在海滨浴场的海水和沙滩中的分布特点.这些研究促使TC、FC和ENT在海水中的研究越来越被人们所关注(龙文芳等，2010).
本文以辽河口为研究区域，对其海水中的粪便污染指示菌(TC、FC和ENT)及环境指标、水化学指标进行分析.研究分析海水中总大肠菌群、粪大肠菌群和肠球菌在夏秋季的数量变化，同一季节粪便污染指示菌在不同空间上的数量变化，以及粪便污染指示菌与环境、水化学指标之间的相关性，为河口生态环境保护提供重要的参考数据，在此基础上选取河口地区合适的粪便污染指示菌，旨在为改善河口整体水环境质量提供管理依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 样品采集2013年8月和10月在辽河口区域进行实验样品采集.依据盐度梯度变化沿河口向外布设17个站位(如图 1所示)，用卡盖式采水器采集每个站位的表层水样，分别装入对应的灭菌瓶，低温4 ℃保存，并于12 h内带回实验室用于细菌学指标的分析，采样同时现场测定了盐度(S)、温度(T)、酸碱度(pH)、氧化还原电位(ORP)、叶绿素a(Chla)、浊度(NTU)和溶氧(DO)7项环境要素指标.
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| 图 1 实验站位采样点分布 Fig.1 Distributions of experimental sampling sites |
总大肠菌群(Total coliform，TC)与粪大肠菌群(Fecal coliform，FC)采用纸片法(大肠菌群测试片，美国3M公司)进行测定，参照说明书进行培养和计数(总大肠菌群培养温度为37 ℃，粪大肠菌群培养温度为44 ℃)；肠球菌(Enterococcus，ENT)采用平板菌落计数法培养计数.环境要素指标S、T、pH、ORP、Chla、NTU和DO通过美国YSI水质仪现场测定；水化学指标亚硝酸盐(NO2--N)、硝酸盐(NO3--N)、磷酸盐(PO43--P)、硅酸盐(SiO34--Si)、铵态氮(NH4+-N)、总磷(TP)、总氮(TN)、悬浮物(SS)和化学耗氧量(COD)采用国标化学方法(GB17378.4—2007)中碱性高锰酸钾法(CODMn)进行测定(国家海洋环境监测中心，2007).
2.3 数据分析采用SPSS 17.0、Surfer 8.0和CANOCO4.5软件进行数据统计与分析.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 河口海水中粪便污染指示菌的时空分布特征辽河口粪便污染指示菌检测指标主要包括TC、FC、以及ENT不同季节数量变化情况，由图 2可知，辽河口夏季FC数量在5.0×102～8.7×104 CFU · L-1之间，TC数量在1.7×105～6.2×106 CFU · L-1之间，ENT数量在1.0×101～2.5×102 CFU · L-1之间；秋季河口FC数量在4.0×102～1.0×103 CFU · L-1之间，TC数量在5.0×102～1.1×104 CFU · L-1之间，ENT数量在3.0×100～9.5×101 CFU · L-1之间.
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| 图 2 辽河口TC(a)、FC(b)、ENT(c)数量变化特征 (以10为底的对数) Fig.2 Abundance variations of TC(a), FC(b),ENT(c) in Liaohe Estuary (With 10 logs base) |
夏秋两季粪便污染指示菌的数量变化区别在于：①TC、FC和ENT的数量夏季高于秋季.原因可能是夏季较秋季降雨频繁使得上游来水量增加同时携带陆地上大量粪便污染物和泥沙进入河流(穆连波和王维志，2013)，造成河口海水中粪便污染指示菌数量增高；②TC、FC和ENT在河口近岸海水中的数量高于远海，且整体数量变化趋势相同.这是由于河口近岸排污口排放污水、人畜粪便等携带粪便污染指示菌进入河口近海，引起近岸粪便污染指示菌数量增高，随着海水稀释作用由近岸向外海其数量逐渐降低.
3.2 河口海水中水化学指标时空分布特征分别于2013年夏季(8月)和秋季(10月)两个季节对辽河口海水水化学指标和环境指标进行了检测，发现夏秋两季水化学指标和环境指标存在明显差异.详见图 3.
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| 图 3 辽河口水化学指标检测结果 (夏季和秋季) Fig.3 Water chemistry index test results of Liaohe Estuary(Summer and Autumn) |
由图 3可见，辽河口夏季水化学指标NO3--N、TN和SiO44--Si含量较高，由河口向外海各个采样站位的水化学指标含量呈逐渐降低的变化趋势；辽河口秋季水化学指标除NO3--N、TN和SiO44--Si外，PO43--P与TP含量比夏季要高，各水化学指标的变化规律体现了污染的陆源输入性.
从夏秋两季的比较来看，夏季河口水体中NO3--N、NO2--N、NH4+-N、和TN的含量高于秋季，而PO43--P、TP、SS的含量则比秋季偏低.原因一方面可能是由人类活动产生的污染物在雨季随雨水和地表径流等途径进入河流，导致氮的含量增加，秋季降雨量减少，输入到河口的陆源污染物减少，河口区域海水氨氮含量逐渐下降；秋季海水磷酸盐与总磷增加可能由于河口海水浊度大、光合作用受到限制，河口初级生产力相应降低，从而导致可溶性无机磷的消耗量减少，而由于高离子强度的作用，陆源输入的大量颗粒磷在河口水体发生离子交换和脱附(Froelich，1988)，同时有机磷在微生物作用下进行分解，从而使DIP(可溶性无机磷)浓度升高，出现所谓的“磷缓冲”(林以安等，2004；于超等，2011)，这与国外研究密西西比河口的变化相似(Fox et al., 1985)，而氨氮则没有这种现象.
3.3 河口海水环境指标时空分布特征对夏秋两季海水环境指标进行比较，由图 4和图 5可见，辽河口盐度变化范围为7.19‰～21.75‰；温度变化范围为15.9～26.9 ℃；pH变化范围为7.43～8.21；DO变化范围为5.5～11.05 mg · L-1，最低点均出现在距离河口最近的1号站位.图 4c中列出了ORP、NTU和Chla 3项环境要素指标，其中NTU在河口近岸较高，Chla在河口淡海水交汇区域含量较高，ORP变化趋势相对恒定.
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| 图 4 辽河口海水环境指标检测结果 (夏季) Fig.4 Seawater environmental factors test results of Liaohe Estuary(Summer) |
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| 图 5 辽河口海水环境指标检测结果 (秋季) Fig.5 Seawater environmental factors test results of Liaohe Estuary(Autumn) |
图 5a和图 5b秋季河口环境指标与夏季有所不同的是：由于季节原因，秋季河口水温较夏季偏低10 ℃左右，同时秋季河口水体pH和DO变化较夏季小.其中盐度变化范围为11.31‰～26.11‰；pH变化范围为8.06～8.16；DO变化范围为7.79 ～8.65 mg · L-1，pH和DO最高值出现在1号站位.图 5cNTU由近岸向外逐渐降低，Chla在河口淡海水交汇区域变化不稳定并出现数个峰值，而ORP变化较为平稳.
综上分析可以看出，在淡海水相互作用下秋季辽河口盐度高于夏季河口盐度，其主要原因是受到降雨和上游来水量的影响；秋季随着降雨减少同时伴随上游来水量的减少，使得河口海水盐度升高.结合2.1节中粪便污染指示菌在夏秋季节数量的变化可以看出：秋季粪便污染指示菌数量低于夏季，即粪便污染指示菌数量降低，对应了环境指标DO浓度升高和海水温度的降低，这与预期结果相一致.究其原因，一方面粪便污染指示菌消耗水体中大量的溶氧，造成海水溶氧浓度降低，同时陆源污染物的增加引起水体化学需氧量的增加；另一方面温度的降低导致粪便污染指示菌活性和生长速率降低.夏季河口海水中粪便污染指示菌与污染物比秋季高，微生物大量消耗水中溶氧，从而夏季水体溶氧较秋季偏低.粪便污染指示菌与NTU变化情况与其他学者得出的结果一致(Fox et al., 1985；Haugl and et al., 2005)，说明河口粪便污染指示菌是附着型微生物，河口水体浊度越高粪便污染指示菌数量越高.
3.4 河口粪便污染指示菌与水化学指标相关性分析分别对夏秋两个季节粪便污染指示细菌和水化学指标进行比较和分析，结果表明：河口水体存在大量不同形式的氮磷污染物.海水中氮磷含量越高，粪便污染指示菌的数量相对越高；在夏秋两季，海水中粪便污染指示菌数量变化与水化学指标的变化规律相一致，两者均表现为显著正相关(沈晓盛等，2010)，分析得出FC和ENT为陆源污染指示微生物.
对9项水化学指标与TC、FC和ENT的数量进行冗余度分析，研究粪源污染指示菌数量与水化学指标之间的相关性，结果如图 6所示.用不同箭头表示细菌和环境指标，箭头连线的长度表示细菌数量与该环境指标相关系数的大小，箭头连线与排序轴的角度表示该环境指标与排序轴相关系数的大小，箭头所处的象限则表示该环境指标与排序轴相关系数的正负.
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| 图 6 冗余度(RDA)分析水化学指标与粪便污染指示菌的相关性 (a.夏季；b. 秋季) Fig.6 Correlation between water chemistry factors and the pollution indicator bacteria in autumn analyzed by redundancy analysis (RDA) (a. summer; b. autumn) |
图 6中不同水化学指标与TC、FC和ENT数量箭头的夹角余弦值通过CANOCO 4.5软件计算得出(夹角余弦值的绝对值代表相关性大小)TC与磷酸盐相关系数为0.530；FC和ENT与硅酸盐、总磷和化学耗氧量化学指标相关性较强，特别与总磷相关性最强，相关系数达到0.785(p < 0.01)；ENT与硅酸盐、总磷、总氮、化学耗氧量的相关系数分别为0.666、0.757、0.637和0.584(p < 0.05).陆源污染物可随污水、雨水及地表径流进入河流，引起河水中粪便污染指示菌和污染物浓度上升，粪便污染指示菌与磷酸盐、总氮和总磷表现出的相关性在一定程度上表明这些粪便污染指示菌与污染物均来自于陆地.由图 6b秋季辽河口水体中TC、FC和ENT与水化学指标相关性分析结果表明，除TC外，FC与亚硝酸盐、铵态氮、硅酸盐、总磷和化学耗氧量相关系数分别为0.634、0.605、0.715、0.546和0.652(p < 0.05)；ENT与铵态氮、总磷、化学耗氧量相关系数分别为0.603、0.793和0.742(p < 0.01)，在夏秋两季粪便污染指示菌与化学指标相关性表现一致.粪便污染指示菌在一定程度上可以对粪源污染物起到指示作用(Huang et al., 1993).因此建议，在河口地区应采用FC和ENT作为粪便污染指示菌.
3.5 河口粪便污染指示菌与环境指标相关性分析对6项水环境指标与TC、FC和ENT的数量进行冗余度分析，研究粪便污染指示菌数量与环境指标之间的相关性，结果如图 7所示.
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| 图 7 冗余度(RDA)分析环境指标与粪便污染指示菌的相关性 (a.夏季; b. 秋季) Fig.7 Correlation between environmental factors and the pollution indicator bacteria in autumn analyzed by RDA (a. summer; b. autumn) |
由图 7a可知，由TC、FC与ENT数量的夹角(夹角余弦值的绝对值代表相关性大小)可以看出FC与ENT有较强相关性(p < 0.05).由环境指标与细菌数量之间的夹角可以看出，环境指标与TC、FC和ENT数量之间的相关性依次为盐度>浊度>酸碱度>溶氧>叶绿素a>氧化还原电位.其中ENT与盐度、酸碱度相关系数分别达到-0.774和-0.730，p值均小于0.01，表现出极强的相关性.
由图 7b可知，环境指标与TC、FC和ENT数量之间的相关性依次为叶绿素a>浊度>酸碱度>氧化还原电位>溶氧>盐度.其中FC、ENT与盐度环境指标相关系数分别为-0.714和-0.745，p值均小于0.01，表现出极强的相关性.
冗余度分析结果表明，辽河口海水中TC、FC和ENT的数量与环境指标密切相关，分析比较后得出：环境指标中盐度和酸碱度变化对粪便污染指示菌数量分布影响较大，盐度在一定环境条件下决定着细菌数量分布.原因一方面是受河口向外海离岸距离远近的影响，随着海水稀释作用粪便污染指示菌数量逐渐降低；另一方面由于粪便污染指示菌对高盐度环境适应性差所导致，来自于陆源低盐度环境的微生物在海水中随着盐度的升高出现不利于其生存与繁殖的高盐度环境，从而出现随盐度增高其数量呈现逐渐下降的变化趋势(Derley et al., 1989).这也进一步解释了粪便污染指示菌的来源和特征，根据本文数据分析建议采用FC与ENT作为河口粪便污染指示菌.
4 结论(Conclusions)1)在时间分布上辽河口粪便污染指示菌数量在夏季高于秋季；在空间分布上粪便污染指示菌由近岸向外海呈逐渐降低的趋势，近岸海水粪便污染指示菌数量远远高于外海.
2)辽河口夏季营养盐主要为NO3--N、SiO44--Si和TN，秋季河口营养盐主要为PO43--P、SiO44--Si和TP；夏季河口海水中TN含量占优势，秋季河口海水中TP占优势.
3)粪大肠菌群与肠球菌在一定程度上可以反映河口粪便污染情况，建议采用粪大肠菌群与肠球菌作为河口粪便污染指示菌.
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