随着采矿、冶炼及镉处理等工业的发展，镉污染日益严重，已成为农田土壤环境中的普遍污染物.环境中的镉十分稳定，浓度过高将对植物造成严重的毒害(Arora et al.,2008).现已证实，过量镉会抑制种子萌发、叶片生长，破坏植物的矿质代谢和水分的平衡，改变叶绿体和细胞膜等超微结构，干扰色素的合成，阻断线粒体电子传递，降低植物的抗氧化能力等(孙光闻等，2005).如何缓解或抑制镉对植物的毒害作用已引起人们的广泛关注.许多研究人员对镉中毒的缓解措施进行了研究，并取得了一定的成果，已有报道的缓解剂包括硅(张丽娜等，2007)、锌(原海燕等，2007)及竹炭(张启伟等，2009)等.

硒是植物生长的有益元素，低浓度的硒能够刺激植物生长发育，提高作物产量与品质，促进植物新陈代谢和植物对环境胁迫的抗性.植物体内的硒还可与重金属离子结合形成金属-硒-蛋白质复合体，进而将重金属排出体外(张驰等，2003; Aiba et al.,2008; Zembala et al.,2010).大量研究表明，硒在缓解重金属对植物的毒害中发挥着重要作用(陈平等，2002; Prado et al.,2010; Yadav et al.,2010).

有关硒降低镉对植物毒害的研究表明，硒可通过抑制植物对镉的吸收、抑制自由基的生成、与镉离子形成螯合蛋白等途径减轻镉对植物的毒性效应(王海男等，2012; Yadav et al.,2010).目前，有关硒缓解镉毒性效应的研究主要集中在植物的地上部等可食用部位.由于吸收、转运和代谢等生理生化过程的作用，掩盖了硒缓解镉毒害作用的真实情况.根尖作为植物体与生长介质中镉最初的接触部位，也是植物体中对外界环境胁迫最为敏感的部位之一，因此，研究污染物对根尖的毒性效应及硒对其缓解作用具有十分重要的意义.然而，目前罕见以植物根尖作为试验材料研究硒对镉毒害缓解作用的报道.因此，本试验选取对镉具有一定富集能力的油菜为试验材料，采用室内MS培养试验，研究0.2 mg · L^-1硒对1 mg · L^-1镉胁迫下油菜幼苗生长、根系构型、根尖膜系统完整性、膜脂质过氧化、自由基生成量、亚细胞超微结构及细胞凋亡程度的影响，从而为揭示硒缓解植物镉中毒提供一定的依据，也为硒的植物逆境生物学功能研究提供理论参考.

供试油菜品种为甘蓝型油菜中双9号.

参照Maria等(2010)的方法，供试油菜种子在70%的酒精中浸泡30 s，再用1.0%的次氯酸钠溶液浸泡15 min，随后用无菌水冲洗5~6次，将消毒好的种子铺于含MS(Murashige and Skoog)培养基的三角瓶中，每瓶放置2粒种子.(25±1)℃、16 h光照/8 h黑暗培养箱中培养30 d.实验设置对照(CK)、镉处理(Cd 1 mg · L^-1)、硒处理(Se 0.2 mg · L^-1)、镉+硒处理(1 mg · L^-1 Cd + 0.2 mg · L^-1 Se)，共4个处理，各处理4次重复.实验中Cd和Se分别以分析纯CdCl₂ · 5H₂O和Na₂SeO₃的形式加入MS培养基.实验中Cd和Se的浓度参照本小组先前的预备实验结果确定.

采用EPSON1680根系扫描仪(Winrhizo2005a根系分析软件)对根系形态进行扫描分析，包括根长、根表面积、根系体积、平均直径、根尖数、分叉数等参数.

采用伊文思蓝染色法测定根尖质膜完整性(Tian et al.，2011).取新鲜根尖若干置于4 mL伊文思蓝试剂(0.025%，g/mL)中，孵育30 min后，室温下去离子水漂洗3次，荧光倒置显微镜观察并拍照.分别采用希夫试剂标记法和TTC法对根尖脂质过氧化(丙二醛生成量)及根系活力进行分析(Djanaguiraman et al.,2005; Tian et al.,2011;Dixit et al.,2001).取新鲜根尖若干与希夫试剂共孵育60 min，用0.5%的K₂S₂O₅溶液漂洗至浅红色，室温去离子水漂洗3次，荧光倒置显微镜观察并拍照.

参照Zhang等(2007)和Djanaguiraman等(2010)的方法测定根尖O^{· -}₂的含量.取1.0 g 根尖，加入65 mmol · L^-1(pH=7.8)的磷酸缓冲液(含10 μmol · L^-1磷酸吡哆醛、1 mmol · L^-1 Na₂EDTA、5 mmol · L^-1 DTT)，匀浆后4 ℃下，2500×g离心10 min.取上清液1 mL，加入0.1 mL羟胺氯化物(10 mmol · L^-1)，25 ℃ 条件下反应 20 min.再分别加入l mL 17 mmol · L^-1的对氨基苯磺酸和1 mL(7 mmol · L^-1)的α-萘胺，25 ℃下继续反应20 min，于530 nm波长下比色.以亚硝酸钠(NO^-₂)作为底物，按上述方法制备标准曲线，并根据标准曲线换算出〖NO^-₂〗，再计算出O^{· -}₂含量，测定结果以nmol · g^-1 鲜样表示.

取各处理新鲜油菜苗根尖(1~3 mm长)固定于4%(V/V)的戊二醛中6~8 h，然后用磷酸缓冲溶液(pH=6.8)冲洗干净，2%四氧化锇固定2 h，梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)脱水，Epon-812环氧树脂包埋，超薄切片机切片(切片厚度为60 nm)，乙酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色，在HITACHI-600透射电镜下分析观察根尖细胞全貌、细胞核、线粒体等主要亚细胞结构的变化(Wu et al.,2014).

参照Bouranis等(2003)和Díaz-Tielas等(2012)的方法，采用吖啶橙(AO)-溴化乙锭(EB)双染标记技术观察根尖细胞核DNA团聚情况，分析根尖细胞程序性死亡状况.

实验数据采用Excel进行处理和作图，采用SPSS 20.0进行方差分析(ANOVA)，应用Duncan多重比较法进行p<0.05水平的显著性分析.结果以4次试验的均值±标准误表示.

镉、硒单独作用及其复合条件下油菜幼苗生长状况见图 1.从图 1a可看出，与对照相比，Se处理组油菜幼苗生长基本正常；Cd和Cd+Se处理组油菜苗瘦小且叶片明显黄化，尤其是Cd处理组油菜幼苗中毒症状最为明显；相比单一Cd处理，Se的添加显著缓解了油菜幼苗的毒害症状.对根系活力(以鲜重计)的测定分析发现(图 1b)，与对照组相比，镉处理显著降低了根系的活力，降幅达35%；而硒单一处理使得根系活力与对照组根系活力相当，甚至其活力高于对照组；与镉处理组相比，硒的添加显著提升了根系的活力.综合性状观察和根系活力结果可知，镉胁迫下，Se的添加有助于降低Cd对油菜幼苗的毒害作用，恢复幼苗的正常生长.

图 1(Fig. 1)

图 1 硒镉对油菜幼苗生长的影响 Fig. 1 Effect of Se and Cd on the growth of rape seedlings

由于油菜生长过程中，根系直接与镉接触，且本实验中观察到，不同处理下油菜幼苗根系的形态差异显著.为深入揭示硒缓解镉对根尖毒害的机理，本研究重点对根系(根尖)生长(形态)进行了分析.图 2是对各处理油菜幼苗根系形态的扫描结果.由该图可看出，镉作用下，硒有助于维系油菜幼苗的根系构型.进而对形态扫描获得的根系形态学系列参数(图 3)进行差异分析，发现硒主要从根系的总根长、总表面积、根尖数、分叉数等方面缓解镉的毒性效应.其中，显著表现在总根长、总表面积和分叉数等参数(图 3a、b、f).与Cd处理相比，Cd+Se使得总根长、总表面积和分叉数分别增加了33.28%、18.81%和21.66%，均达到了显著差异(p<0.05).根系形态研究表明，镉胁迫下，硒的添加在一定程度上恢复了根系的生长.在该实验浓度范围内，硒未能完全消除镉对油菜幼苗根系生长的抑制.

图 2(Fig. 2)

图 2 不同处理下油菜根系构型图 Fig. 2 Morphology of rape seedlings growing under different treatments

图 3(Fig. 3)

图 3 不同处理对油菜根系构型形态参数的影响 Fig. 3 Root morphological characteristics of rape seedlings growing under different treatments

为深入分析镉胁迫下，硒在根系形态恢复中所发挥的作用，对根系形态的几个主要参数包括总根长、总表面积和总体积进行了解析.以直径为1.0 mm为限，分别计算了直径小于1.0 mm和大于1.0 mm的根系总根长、总表面积和总体积，并分别进行了方差分析.如表 1所示，与镉单一处理相比较，添加硒显著恢复了根系形态，主要表现在对直径小于1.0 mm的根系的恢复.其中，镉胁迫下，添加硒使得直径小于1.0 mm 的根系总根长提高了44.73%，总表面积提高了37.35%，总体积提高了32.88%，均达到了显著差异(p<0.05).直径大于1.0 mm的根系总根长、总表面积和总体积未见显著变化.

表 1(Table 1)

表 1 各处理对不同直径范围内根系主要形态学参数的影响 Table 1 Differences of distribution of root length，surface area，and volume with different root diameter ranges under different treatments

表 1 各处理对不同直径范围内根系主要形态学参数的影响 Table 1 Differences of distribution of root length，surface area，and volume with different root diameter ranges under different treatments 处理 总根长/(cm·plant-1) 总表面积/(cm2·plant-1) 总体积/(cm3·plant-1) 0~1.0 mm >1.0 mm 0~1.0 mm >1.0 mm 0~1.0 mm >1.0 mm 注：表中数据以均值±标准误表示，同一列不同字母间表示差异显著(p<0.05). CK 105.98±11.96a 33.12 ± 10.03a 10.49 ± 0.77a 4.25 ± 0.59a 0.0644 ± 0.0071ab 0.0783 ± 0.0152a Cd 63.22± 3.15b 20.18 ±0.31a 6.64± 0.61b 4.17 ± 0.19a 0.0517 ± 0.0038b 0.0808 ± 0.0095a Se 98.05 ± 3.28a 22.28 ± 3.09a 8.85 ± 0.78a 4.07 ± 0.57a 0.0689 ± 0.061a 0.0838±0.0085a Cd+Se 91.50± 2.05a 19.80 ± 1.45a 9.12 ± 0.09a 3.82± 0.31a 0.0687 ± 0.0025a 0.0632 ± 0.0053a

镉对植物细胞的毒害作用往往表现在对膜系统的氧化损伤等方面.根系膜系统作为重要防御屏障，是衡量外界污染物对生物体毒性效应的主要指标之一.本研究采用伊文思蓝染色法分析了镉胁迫及硒配合作用下，根尖膜系统的完整性(图 4a).由图 4a可看出，各处理根尖均有大量细胞膜系统受损(蓝色)，其中，镉胁迫下，根尖(尤其是分生区)细胞死亡较严重.镉胁迫下同时添加硒处理，根尖分生区膜系统受损状况稍有缓解.

为进一步研究根尖细胞的氧化损伤状况，本研究通过希夫试剂染色分析发现，镉胁迫致根尖细胞膜系统损伤严重，产生了大量的丙二醛(MDA)，而硒的添加显著降低了膜损伤程度(MDA含量降低)(图 4b).作为生物体氧化受损的标志性产物活性氧(ROS)之一——超氧阴离子(O^{· -}₂)含量(以鲜重计)呈现出与MDA基本一致的规律(图 4c).Cd处理组根尖O^{· -}₂含量较对照极显著增加，为对照组O^{· -}₂含量的3倍左右；而与Cd单一处理相比，Cd+Se处理使得根尖O^{· -}₂含量降低了67.47%，达到了极显著水平(p<0.01).

图 4(Fig. 4)

图 4 不同处理下根尖膜系统的完整性及其氧化损伤状况(a.伊文思蓝染色显示根尖膜系统完整性情况；b.希夫试剂染色显示根尖细胞膜氧化损伤情况c.根尖超氧阴离子的产生情况) Fig. 4 Oxidation and integrity of membrane in root tip under different treatments

为进一步分析硒在微观层次上发挥的缓解镉毒害作用的效果，本研究采用透射电镜观察了不同处理根尖细胞的超微结构变化(图 5).由图 5可看出，对照组细胞膜结构完整，核仁清晰，核膜明显，细胞膜周围分布着清晰的液泡等细胞器；与对照相比，各处理均影响到根尖细胞的超微结构.其中，镉胁迫下明显可见细胞排列与细胞形态发生紊乱，细胞核解体或边缘化，线粒体出现空泡化现象；硒单一作用下，细胞核DNA出现少量团聚、染色质浓缩，但未见细胞核解体；镉硒同时作用下，细胞亚显微形态较镉单独作用下受损伤程度明显降低.表明镉胁迫下，硒可在一定程度上维持细胞超微结构的完整性.

图 5(Fig. 5)

图 5 镉硒处理对油菜苗根尖细胞超微结构的影响(a，e: CK; b，f: 1 mg · L-1 Cd; c，g: 0.2 mg · L-1 Se; d，h: 1 mg · L-1 Cd+0.2 mg · L-1 Se；标尺a，b，c，d为2 μm; e，f，g，h为1 μm；b，d中箭头指代细胞形态或膜形态差异；f，g，h中箭头指代线粒体或细胞核形态差异) Fig. 5 Effect of Cd and Cd plus Se on ultrastructure of root tip cells

镉毒害可导致植物遗传物质发生变化，不同程度地引起细胞程序性死亡(PCD).为弄清镉胁迫下，硒是否有助于降低镉的遗传毒性效应，本研究采用AO-EB双染的方法，分析了不同处理下根尖细胞PCD情况，以探讨硒在维持细胞遗传完整性方面发挥的作用.由图 6可看出，对照及硒单独作用下，油菜根尖细胞活力旺盛，染色体形态基本完整，细胞正常或少量早期凋亡，未见大量细胞凋亡或死亡；而镉单一胁迫下，根尖细胞大量死亡，或凋亡晚期细胞数量增加，添加硒未能显著减少根尖凋亡或死亡细胞数量，仅降低了凋亡晚期细胞的比例.

图 6(Fig. 6)

图 6 不同处理下根尖细胞凋亡差异分析(绿色均匀荧光表示细胞染色体形态正常；绿色团聚呈现光亮荧光表示细胞凋亡早期；橙红色均匀荧光表示细胞凋亡晚期；红色团聚呈现光亮荧光表示细胞死亡；图中标尺为100 μm) Fig. 6 Progress of programmed cell death(PCD)induced by Cd in the roots tips of the plant growing under different treatments

Cd是生物毒性最强的重金属之一，植物幼苗生长过程中，Cd对植物根尖具有直接的毒性作用，可破坏植物根尖细胞、抑制根部的细胞分裂和伸长(宋玉芳等，2001).已有的研究证实，Se可有效缓解Cd胁迫对植物造成的毒害(王立新等，2009;Lin et al.,2012;Fenget al.，2013).本研究结果与前人报道基本一致：0.2 mg · L^-1 Se显著减轻了1 mg · L^-1 Cd对油菜幼苗的毒害作用.其中，对根系表面积、分叉数等的影响显得最为明显，表明Se的添加可显著缓解镉对根部细胞分裂和伸长的抑制，这可能与镉在MS培养基中形态发生变化有关.镉单一形式存在于培养基中主要以离子交换态被根系吸收，而硒的添加可能使得镉硒复合形成不易被植物吸收的硒镉难溶复合物，减少了MS培养基中游离镉离子的浓度，进而降低了镉对幼苗根系细胞分裂的影响(段昌群等，1994;王海男等，2012).作物可以通过某种机制感知根际环境变化，进而启动体内特定基因的表达和相应的生理生态反应，最终通过根系的形态和生理学变化，来调节对外源物的吸收或抵御(Lynch，1995; 赵首萍等，2006).目前，关于有益元素对作物根系构型的研究相对较少.本研究验证了低浓度的硒可在一定程度上维持根系细胞超微结构的完整性.

Cd对植物毒害的最突出表现就是造成机体膜脂质过氧化，进而诱导自由基对生物有机体进行攻击.硒最主要的生理功能就是抗氧化作用，尤其在清除植物体内过量自由基、防止脂质过氧化方面作用明显.少量硒可以极大地降低活性氧(ROS：H₂O₂和O^{· -}₂)和MDA的累积，增强酶类和非酶类抗氧化系统(Cartes et al.,2010; Han et al.,2013).因此，镉胁迫下，硒的存在可抑制镉造成的自由基过氧化损伤，并与镉竞争Ca²⁺、Mg²⁺等离子通道，维系了根系膜系统的完整性，降低过氧化程度(龚鹏飞和袁慧，2003).本研究中，0.2 mg · L^-1 Se显著降低了根尖细胞膜MDA生成量，并使得O^{· -}₂含量降低67.47%，因此，维持了膜系统的完整性，确保根尖细胞正常分裂生长.此外，我们发现，单一硒处理并未显著改变根尖的脂质过氧化等细胞内环境.这也进一步证实了在外界因子胁迫下，硒对根尖的积极作用更加明显，硒与镉的拮抗作用大于硒对植物体的单一作用.

对根尖超微结构分析得出了基本一致的结论：镉胁迫下细胞核解体或边缘化，核DNA出现少量团聚，染色质浓缩，线粒体出现空泡化现象，而硒的添加，大大降低了镉对细胞亚显微结构的损伤.这可能与根尖膜系统脂质过氧化产生的MDA，尤其是O^{· -}₂等自由基得到了及时的清除密切相关.然而，本实验浓度范围内，硒并未完全消除镉对机体的损伤，且硒单一作用下也对根尖亚细胞结构产生了轻微的损伤.这也反映了植物体内硒的功能依赖于浓度和细胞定位的不同，可以在细胞中引起有益和毒害两个方面的作用.

细胞凋亡是高等植物生长发育及新陈代谢的一个重要生理过程，对植物的生长意义重大.外界环境中凡是对细胞有损伤的因子都可诱导细胞出现凋亡.已有研究表明，镉可与细胞内物质结合，使得染色体出现凝集现象和断裂，诱导染色体畸变，严重时破坏DNA结构和组成，从而严重影响到细胞的正常分裂(赵红梅等，2011).本实验中，镉单一胁迫下，根尖细胞大量死亡或凋亡晚期细胞数量增加；添加硒降低了根尖凋亡晚期细胞的比例，但未能显著减少根尖凋亡或死亡细胞数量.这表明在本实验浓度范围内，硒尚不能有效降低镉与细胞内物质的结合，进而降低镉致根尖细胞凋亡的程度.

1)镉(1 mg · L^-1)严重抑制了油菜幼苗生长，致使油菜叶片黄化，根系活力降低，根系生长发育受阻；低浓度(0.2 mg · L^-1)的硒显著降低了镉的毒害，基本维系了根系的活力、构型和正常生长，确保根系的总根长、总表面积和分叉数维持正常，主要表现在对直径小于1.0 mm的根系的恢复.

2)本实验浓度范围内，硒本身也对根尖膜系统、细胞活力、细胞超微结构等造成了轻微的破坏，但在镉胁迫下添加硒，有助于缓解镉对根尖细胞膜系统完整性的破坏，降低膜脂质过氧化程度，减少自由基的生成，维持细胞核的形态和细胞器的结构完整性.然而，硒未能完全消除镉对油菜幼苗根尖的毒性效应.

3)镉胁迫导致油菜幼苗根尖发生细胞凋亡甚至细胞死亡；硒单独作用下，维持了根尖细胞遗传物质的完整性和遗传活力；然而，1 mg · L^-1镉胁迫下，添加0.2 mg · L^-1的硒并不能显著降低根尖细胞死亡数量，仅降低了晚期凋亡细胞的比例.