大气细颗粒物(PM_2.5，即空气动力学直径≤2.5 μm的颗粒)是灰霾天气发生时的首要污染物，由于PM_2.5较易吸附空气中的有毒有害物质(如重金属、挥发性有机化合物和多环芳烃等)，且可以进入下呼吸道到达肺泡，因而对人体健康产生严重威胁(Perrone et al., 2010；Boublil et al., 2013).流行病学研究表明，灰霾可以增加急性呼吸道疾病、支气管哮喘、心血管系统疾病及皮肤病的发病率，甚至和糖尿病的发生呈正相关(Pui et al., 2014；Goldberg et al., 2001)，而这些影响的发生主要与灰霾天气下大气PM_2.5浓度增高有关(阚海东等，2002).

近年来，灰霾天气在我国各地时有发生，尤其京津冀、长三角等地有愈演愈烈的趋势，有关灰霾的健康影响及毒理机制正受到越来越多的关注(Gualtieri et al., 2010；Zhang et al., 2008；Lee et al., 2014).基于此，本文以山西省太原市发生严重灰霾天气时采集的大气PM_2.5为实验材料，通过体外染毒试验，研究PM_2.5对肺泡巨噬细胞(AM)存活率、胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平及Ca²⁺浓度的影响，并观察细胞凋亡程度，旨在从AM氧化损伤和细胞凋亡方面揭示灰霾PM_2.5的健康危害效应和毒理机制.

主要试剂：RPMI-1640培养基(Thermo Fisher公司)，小牛血清(浙江天杭生物有限公司)，牛血清蛋白(BSA)、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)(Solarbio公司)，二甲基亚砜(DMSO)、考马斯亮蓝-G250(Sigma公司)，SOD试剂盒、MDA试剂盒、GSH-Px试剂盒(南京建成公司)，活性氧(ROS)检测试剂盒、钙离子荧光探针Fluo-3 AM(碧云天)，Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(Invitrogen公司).

主要仪器：高速低温离心机(Sigma，Germany)、酶标仪(Bio-rad Model 550)、细胞恒温培养箱(Thermo，美国)、Accuri C6流式细胞仪(BD，美国).

大气PM_2.5采样地点位于山西大学环境与资源学院楼顶，距地面约20 m，采样时间为2011年12月30—31日，采样期间气温-8.1~1.2 ℃，相对湿度50.3%~86.8%，能见度0.1~1.0 km，风速0~1级，气溶胶在线检测仪8530(美国TSI仪器公司)测得PM_2.5日平均质量浓度为957 μg · m^-3，为典型的灰霾天气(曹玲娴等，2014).使用大流量(1.13 m³ · min^-1)大气PM_2.5采样器(Thermo Andersen)采集样品，采样膜为石英纤维滤膜(Whatman).采样结束后，将载有PM_2..5的石英纤维滤膜称重、剪碎后放入Milli-Q超纯水中超声振荡以洗脱颗粒物，收集悬浮液并真空冷冻干燥，低温保存，实验时用0.9%生理盐水配成母液(耿红等，2006a).

每次实验选取体重为220~250 g的清洁、健康雄性Wistar大鼠3只，每只注射1.2 mL 1%的戊巴比妥钠，待全身麻醉后，腹主动脉放血致死，用灭菌的磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.0)灌洗双肺，将肺泡灌洗液(BLAF)于3000 r · min^-1、4 ℃下离心10 min.弃上清液，细胞沉淀用含10%小牛血清的培养液洗涤2次，制成细胞悬浮液.用台盼蓝拒染法计数，稀释细胞浓度为2×10⁶个 · mL^-1，分装于细胞培养皿，放于37 ℃、5%CO₂培养箱中孵育2 h.弃原培养液，用PBS清洗2次，去除非贴壁细胞和原培养液成分，此时AM纯度可达95%以上.

加入不同浓度的灰霾PM_2.5悬浮液染毒，终浓度分别为33、100、300 μg · mL^-1，同时设阴性对照组(只加培养液和同量的生理盐水).染毒4 h后，用胰酶消化收集细胞，进行SOD、MDA、GSH-Px、ROS、Ca²⁺浓度和细胞凋亡的测定.

采用MTT法测定细胞存活率.将浓度为1.5×10⁵个 · mL^-1的AM细胞悬浮液加入96孔培养板，每孔添加100 μL，于37 ℃细胞培养箱中培养2 h.之后吸出培养液，添加不同浓度的PM_2.5染毒液，同时设置对照组.培养4 h后，吸出染毒液，每孔添加120 μL含MTT的培养液继续培养4 h.然后吸出MTT溶液，用PBS清洗一次后，每孔添加150 μL DMSO，室温下缓慢摇晃至蓝紫色结晶全部溶解，酶标仪490 nm处测定吸光值.

采用试剂盒进行测定，按照试剂盒说明进行操作，用酶标仪测量其吸光值，并分别计算出SOD、GSH-Px活性和MDA含量.

贴壁2 h后收集AM于2 mL EP管中，PBS清洗1次，按照1∶2500的比例用无血清培养液稀释DCFH-DA(二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯)，每管添加DCFH-DA工作液1 mL，37 ℃孵育25 min后，3000 r · min^-1离心10 min，PBS清洗3次.然后添加不同浓度灰霾PM_2.5染毒液对细胞进行染毒4 h，并且提前30 min对阳性对照管添加Rosup刺激物.4 h后，打匀细胞，过滤(200目)，用流式细胞仪检测ROS，检测的荧光强度可反应细胞内ROS水平.

染毒4 h后收集AM于2 mL EP管中，PBS清洗3次，按1∶5000的比例用DMSO稀释Fluo-3 AM，每管添加Fluo-3 AM工作液1 mL，37 ℃孵育30 min后，3000 r · min^-1离心10 min，PBS再次清洗，最后用1 mL PBS重悬，打匀细胞，每孔添加200 μL于96孔板，用多功能酶标仪进行荧光检测.分别设定激发波长488 nm，发射波长525 nm，测定静息荧光值F，然后加入终浓度为0.1%的Triton-X 100溶液，测得最大荧光值F_max，再加入0.05 mol · L^-1的EDTA溶液，测得最小荧光值F_min.按下面公式计算Ca²⁺浓度：

[Ca²⁺]=K_d ·(F-F_min)/(F_max-F)

式中，K_d为荧光剂与结合反应的解离常数，取值为400 nmol · L^-1.

染毒4 h后收集AM于2 mL EP管中，预冷PBS清洗2次，将细胞重悬于100 μL 1×annexin binding-buffer，使浓度稀释为1×10⁶个 · mL ^-1，每个待测样品分别加入5 μL Annexin V和1 μL PI，避光室温培养15 min，最后添加400 μL 1×annexin binding-buffer，过滤(200目)，上流式细胞仪检测，通过二维点图以双参数显示结果.获得的细胞散点图由4个象限组成，散点图左下象限代表活细胞，右上象限代表晚期凋亡细胞，右下象限代表早期凋亡细胞.

实验数据以平均值±标准误差(Mean±SD)表示，用Origin 8.0软件进行数据统计分析，采用one-way ANOVA单因素方差分析，并用LSD检验法进行两两比较，p＜0.05表示差异有显著性.

实验结果(图 1)表明：随着灰霾PM_2.5悬浮液浓度的增大，AM的存活率呈降低趋势，依次降低了3.7%、12.3%和19.9%，但33 μg · mL^-1和100 μg · mL^-1染毒组与对照组相比，差异不显著，300 μg · mL^-1染毒组与对照组相比出现显著差异(p＜0.05).

图 1(Fig. 1)

图 1 灰霾PM2.5对AM存活率的影响(n=5，与对照组相比，*p＜0.05) Fig. 1 Effects of haze PM2.5 on the survival rate of AM(n=5，compared to the control，*p＜0.05)

如图 2所示，不同浓度灰霾PM_2.5悬浮液处理大鼠AM细胞后，其SOD活性(以prot计)随着染毒浓度的增大而减小，且呈现剂量-效应关系.染毒组SOD活性与对照组相比，分别降低了37%、40.7%、50.2%，各浓度处理组与对照组相比差异显著(p＜0.05或p＜0.01)，但染毒组之间没有显著差异.

图 2(Fig. 2)

图 2 灰霾PM2.5对AM中SOD活性的影响(n=5，与对照组相比，*p<0.05，* *p<0.01) Fig. 2 Effects of PM2.5 on the activity of SOD in AM(n=5，compared to the control，*p<0.05，* *p<0.01)

由图 3可以看出，随着灰霾PM_2.5悬浮液浓度的增加，AM中GSH-P_X活性(以prot计)呈递减趋势，浓度为33、100 μg · mL^-1时，与对照组相比无显著差异，当浓度为300 μg · mL^-1时，GSH-Px活性比对照组降低了12.6%，且差异显著(p＜0.05)，但各染毒组之间GSH-Px活性差异不显著.

图 3(Fig. 3)

图 3 灰霾PM2.5对AM中GSH-Px活性的影响(n=5，与对照组相比，*p<0.05) Fig. 3 Effects of haze PM2.5 on the activity of GSH-Px in AM(n=5，compared to the control，*p<0.05)

由图 4可以看出，各染毒组MDA含量(以prot计)随着灰霾PM_2.5悬浮液浓度的增大而显著增加，与对照组相比，3个染毒组MDA含量分别增加了0.55、0.67、3.76倍，差异显著(p＜0.05或 p＜0.01).300 μg · mL^-1染毒组与其他浓度染毒组相比，也具有显著差异(p＜0.05)，说明高染毒浓度组造成AM严重的脂质过氧化.

图 4(Fig. 4)

图 4 灰霾PM2.5对AM中MDA含量的影响(n=5，与对照组相比，*p<0.05，* *p<0.01，* * *p＜0.001；与33 μg · mL-1染毒组相比，▲p＜0.05；与100 μg · mL-1染毒组相比，#p＜0.05) Fig. 4 Effects of haze PM2.5 on the content of MDA in AM(n=5，compared to the control，*p＜0.05，* *p＜0.01，* * *p＜0.001; compared to the treatment of 33 μg · mL-1，▲p＜0.05; compared to the treatment of 100 μg · mL-1，#p＜0.05)

如图 5所示，随着灰霾PM_2.5染毒浓度的增大，AM内ROS的平均荧光强度逐渐升高，呈剂量-效应关系.浓度为33、100和300 μg · mL^-1时，平均荧光强度分别是对照组的1.25、1.51和1.62倍，染毒浓度大于100 μg · mL^-1时，与对照相比差异显著(p＜0.01或p＜0.001).而且300 μg · mL^-1染毒组与33 μg · mL^-1染毒组相比，也具有显著差异(p＜0.05).

图 5(Fig. 5)

图 5 灰霾PM2.5对AM中ROS含量的影响(n=5，与对照组相比，* *p<0.01，* * *p＜0.001；与33 μg · mL-1染毒组相比，▲p＜0.05 ) Fig. 5 Effects of haze PM2.5 on the cellular ROS level(n=5，compared to the control，* *p＜0.01，* * *p＜0.001; compared to the treatment of 33 μg · mL-1，▲p＜0.05)

如图 6所示，随着灰霾PM_2.5悬浮液浓度的增大，胞质内游离Ca²⁺浓度增加，且存在一定的剂量依赖关系.与对照组相比，染毒浓度为300 μg · mL^-1时，出现了极显著差异(p＜0.001)，而与其它染毒组相比，高浓度染毒组也出现了显著差异(p＜0.05).

图 6(Fig. 6)

图 6 灰霾PM2.5对AM中Ca2+浓度的影响(n=5，与对照组相比，* * *p＜0.001；与33 μg · mL-1染毒组相比，▲▲p＜0.01;与100 μg · mL-1染毒组相比，#p＜0.05) Fig. 6 Effects of haze PM2.5 on cellular Ca2+ concentration(n=5，compared to the control，* * *p＜0.001; compared to the treatment of 33μg · mL-1，▲▲p＜0.01; compared to the treatment of 100 μg · mL-1，#p＜0.05)

从图 7可以看出，对照组与3个染毒组细胞早期凋亡率依次为3.3%、4.2%、4.7%、5.1%，呈升高趋势.5次实验数据统计分析表明(表 1)，随着灰霾PM_2.5染毒浓度的升高，AM的早期凋亡率也逐渐升高，与对照组相比，当PM_2.5处理浓度大于100 μg · mL^-1时，差异显著(p＜0.05)，300 μg · mL^-1染毒组与33 μg · mL^-1染毒组相比，差异也显著(p＜0.05).

图 7(Fig. 7)

图 7 流式细胞仪测定AM凋亡图(a.阴性对照组;b.33 μg · mL-1染毒组;c.100 μg · mL-1染毒组;d.300 μg · mL-1染毒组) Fig. 7 The figures of AM apoptosis by FCM(a.control;b.the treatment of 33 μg · mL-1;c.the treatment of 100 μg · mL-1;d.the treatment of 300 μg · mL-1)

表 1(Table 1)

表 1 不同浓度的灰霾PM2.5对AM凋亡率的影响 Table 1 Effects of haze PM2.5 on the apoptosis rate of AM

表 1 不同浓度的灰霾PM2.5对AM凋亡率的影响 Table 1 Effects of haze PM2.5 on the apoptosis rate of AM 灰霾PM2.5浓度/(μg·mL-1) AM早期凋亡率 注：n=5；与对照组相比，*p＜0.05，* *p＜0.01，与33 μg · mL-1染毒组相比，▲p＜0.05. 0(对照组) 3.9%±1.3% 33 5.2%±0.8% 100 5.9%±1.2%* 300 7.6%±1.5%**▲

肺泡巨噬细胞(AM)是呼吸系统重要的免疫防御细胞.当大气PM_2.5随着呼吸进入肺泡后，AM发挥吞噬、免疫和分泌作用，对其及时进行清除.但当PM_2.5浓度超过一定量后，就会引起AM一系列生理生化指标的变化，甚至发生损伤与凋亡(徐佳等，2008).

本实验结果证实，灰霾PM_2.5处理AM后，可以使AM发生氧化损伤和凋亡，并呈现剂量-效应关系，说明灰霾PM_2.5浓度越高，对AM的毒性作用越大.在测定各氧化损伤指标中，SOD和GSH-Px是两种重要的抗氧化酶，可以清除体内的超氧阴离子(O^2-)、H₂O₂等活性氧和自由基，其活性大小可以间接反映细胞清除活性氧和自由基的能力(宋姗娟等，2014)；MDA是脂质过氧化的最终产物，是细胞受损伤的标志，其本身又会对细胞造成一定伤害，MDA的生成量间接反映细胞受氧化损伤的程度(Geng et al., 2005).当体内活性氧浓度过高时，SOD和GSH-Px活性会下降，MDA含量会上升(徐雯等，2013).本实验发现，大于33 μg · mL^-1的灰霾PM_2.5即可使MDA含量显著升高(p＜0.05)，会使AM发生脂质过氧化，随着PM_2.5浓度增大，细胞脂质过氧化程度也增大，这与郭翔等(2012)的实验结论一致.同时，灰霾PM_2.5可使AM胞内活性氧水平显著提高(特别是高浓度组)，进一步说明AM的脂质过氧化极有可能是由ROS增高引起的.这些由灰霾PM_2.5诱导产生的ROS一方面可以直接和抗氧化物酶(如SOD、GSH-Px)反应，降低它们的活性(Pamplona et al., 2011)，如图 2和图 3所示；另一方面，过量的ROS还可以对细胞的DNA、RNA和蛋白质造成损伤，破坏正常的细胞周期，从而导致细胞的早期凋亡(图 7和表 1)，并导致细胞存活率降低(图 1)(Azad et al., 2009).

细胞对外界环境的刺激反应是通过胞质内Ca²⁺浓度的变化来传递的，氧化应激可导致细胞内游离Ca²⁺浓度升高，破坏细胞内的钙稳态，引发一系列的不良反应(Grover et al., 2003);同时，胞质内高浓度的Ca²⁺又会导致更多自由基或ROS产生(Clausen et al., 2013)，使细胞受到氧化损伤.本研究中灰霾PM_2.5使细胞内Ca²⁺浓度显著升高，表明细胞内的钙稳态已遭到破坏.高浓度Ca²⁺和ROS可引发线粒体膜通透性转运孔道开放，使大量凋亡相关蛋白从线粒体膜间隙释放出来(刘健康等，2012)，从而诱导AM发生凋亡，该凋亡的发生说明灰霾PM_2.5对细胞的损伤很可能是通过过量ROS和Ca²⁺浓度升高而介导的.

除了作用剂量外，灰霾PM_2.5的毒性作用与它所含成分紧密相关(耿红等，2006b；Ghio et al., 2012).本实验所用的灰霾PM_2.5的化学成分特征与非霾样品有较大不同(曹玲娴等，2014).灰霾PM_2.5中的重金属Pb、As、Hg含量，水溶性阴离子Cl^-、SO^2-₄、NO^-₃、F^-和阳离子K⁺、Na⁺含量，以及OC和EC比值均高于非灰霾样品.可见，灰霾发生时，大气PM_2.5携带了更多人为污染物质，如Pb、As、Hg元素、二次气溶胶、化石燃料的燃烧产物等.正是由于这些人为污染物的增多使得灰霾PM_2.5成分更复杂，对AM的氧化损伤作用可能更强烈.

研究表明，太原市冬季灰霾PM_2.5导致大鼠肺泡巨噬细胞抗氧化物酶(SOD、GSH-Px)活性降低，ROS含量和Ca²⁺浓度增加，脂质过氧化水平和早期凋亡率上升，细胞存活率下降.说明冬季灰霾天气下大气细颗粒物可对AM造成氧化损伤，该损伤作用的产生可能与灰霾PM_2.5含有的大量二次气溶胶、重金属及煤炭燃烧产物有关.