集约化畜牧业的发展导致兽药大量使用，磺胺类和喹诺酮类药物是应用比较普遍的两类兽药抗生素(刘锋等，2013).研究发现，β-受体激动剂类药物由于在促进饲料转化、提高瘦肉率等方面效果明显，因而在我国畜牧业中虽已被禁止使用但仍屡禁不止(沈建忠等，2011).磺胺类和喹诺酮类兽药抗生素和β-受体激动剂类药物难以被动物肠胃吸收，约30%~90%会以原型通过畜禽粪便直接释放到环境中(国彬等，2011；申屠芬琴等，2007).同时，由于畜禽养殖业大多分散于我国农村和城镇周围，畜禽粪便未能进行有效处置，导致大量残留兽药进入环境中，可能带来生物毒性及导致致病菌产生抗药性基因等环境风险和生态风险(Kim et al.,2011)，并可对人群健康产生危害(王培龙，2014).

残留兽药可通过养殖废水及粪便的使用进入土壤和地下水环境中，成为备受关注的新型环境有机污染物(祁彦洁等，2014).Barnes等(2008)对美国18个州47处地下水进行了取样检测，在81%的水样中检测到有机污染物质，其中，由于人畜用药产生的污染物质占总检出量的23%.我国作为兽药生产和使用大国，地下水中兽药残留相关调查还很不全面，相关文献报道较少，而建立地下水中多种兽药残留的分析测定方法是开展兽药残留在地下水中迁移累积，以及评估环境风险的基础.

对地下水中的兽药残留进行监测的一个重要手段就是建立能够快速、准确地进行残留分析的方法.目前，国内外报道的药物残留检测方法主要有液相色谱法(HPLC)(国彬等，2011)、毛细管电泳-质谱联用法(CE-MS)(Suárez et al.,2007)、液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)(López-Serna et al.,2011)、酶联免疫法(Shelver et al.,2008)等，而LC-MS/MS在多种药物残留检测的应用是目前的研究热点，但目前在地下水中对上述三大类药物同时检测的方法还没有.本文基于UPLC-MS/MS建立一种可同时检测地下水中23种常用兽药药物残留的高通量检测技术，以期为地下水中药物残留的监测提供参考.

岛津超高效液相色谱(LC-30A)与三重四极杆质谱联用系统(LCMS-8030)，配有LC-30AD×2输液泵、DGU-20A5在线脱气机、SIL-30AC自动进样器、CTO-30AC柱温箱、CBM-20A系统控制器、LCMS-8030三重四极杆质谱仪、Labsolution ver. 5.41 色谱工作站；Kinetex^TM UPLC C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；HLB固相萃取小柱(Waters，6cc)；TranssonicTP 690超声波清洗器(Elma 公司)；3K15离心机(Sigma 公司)；Millipore Elix Milli-Q纯水仪.

甲醇、乙腈均为色谱纯(Fisher Scientific公司)，超纯水，其他试剂均为分析纯.所用23种药物均是商购获得，各药物的纯度均高于98.0%，分别为β-受体激动剂类药物、喹诺酮类药物、磺胺类药物.

β-受体激动剂类药物：西马特罗(Cimaterol)、沙丁胺醇(Salbutamol)、莱克多巴胺(Ractopamine)、氯丙那林(Clorprenaline)、克伦特罗(Clenbuterol)、妥布特罗(Tulobuterol)、内标克伦特罗-D9(Clenbuterol-D9).

喹诺酮类药物：培氟沙星(Pefloxacin)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、吡哌酸(Pipemidic Acid)、萘啶酸(Nalidixic Acid)、洛美沙星(Lomefloxacin)、二氟沙星(Difloxacin).

磺胺类药物：磺胺邻二甲氧嘧啶(Sulfadoxine)、磺胺噻唑(Sulfathiazole)、磺胺吡啶(Sulfapyridine)、磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine)、磺胺二甲基 唑(Sulfamoxol)、磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine)、磺胺甲噻二唑(Sulfamethizole)、磺胺甲 唑(Sulfamethoxazole)、磺胺二甲异 唑(Sulfisoxazole)、磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine).

分别精密称取上述3类混合药物对照品，置于500 mL量瓶中，用甲醇分别配制成100.0 μg · mL^-1 的标准储备液.准确吸取上述储备液各1.0 mL共3 mL至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得10.0 μg · mL^-1 的混合标准储备液.从中准确吸取1.0 mL的混合标准储备液置于10.0 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得1.0 μg · mL^-1的混合标准工作液.

模拟地下水样的配制，分别取适量的混合标准工作液，用纯水定容，配制成1.0 μg · L^-1的混合模拟水样.

依次用5.0 mL甲醇、5.0 mL超纯水活化HLB固相萃取柱，加液后保持5 min，开真空泵抽取液体，然后调节至合适的真空度，取模拟地下水样，使用0.45 μm纤维滤膜去除水中悬浮颗粒物，使水样以4.0 mL · min^-1的恒定流速过柱(固相萃取柱填料上界面始终不能接触空气)，待水样完全通过后，各固相萃取柱依次用5.0 mL的淋洗液以冲洗杂质，再用适量体积的洗脱液对各固相萃取柱进行洗脱，之后将洗脱液收集于15 mL离心管中，在室温下用微弱的氮气吹干，再用初始流动相定容至1.0 mL，涡旋混匀，过微孔滤膜，待留UPLC-MS/MS分析.

色谱柱为Kinetex^TM UPLC C₁₈柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：A相为甲醇，B相为0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱：0~8.0 min为3.0%A~90.0%A；10.0~10.1 min为90.0%A~3.0%A；10.1~13.0 min为3.0%A；流速为0.25 mL · min^-1；柱温为30 ℃；进样量为10 μL.

电喷雾离子源(ESI+)，毛细管电压为3.5 kV，锥孔电压为3.0 V，RF透镜电压为0.5 V，源温为110 ℃，脱溶剂温度为350 ℃，脱溶剂气流速为650 L · h^-1，锥孔反吹气流速为50 L · h^-1.

本文以超高效液相色谱串联质谱技术为检测手段，通过对固相萃取条件的优化，建立了适用于地下水中23种目标药物残留的前处理富集方法.根据药物的理化性质，选择在不加任何酸碱的条件下进行固相萃取，可同时获取磺胺类药物、激动剂类药物及喹诺酮类药物3类药物较好的回收率.此外，本文对比了不同淋洗液组成，结果表明，在以超纯水为淋洗液时即可去除萃取柱上的基质干扰物，又可以达到维持目标分析物的目的.同时，还比较了不同洗脱液的洗脱能力，实验表明，甲醇对各药物的洗脱效果最好.

将所述的23种药物分别进行MS扫描，确定各个药物的定性离子和定量离子，并优化各个药物离子对的碰撞电压.为了提高分析的灵敏度和专一性，选用多反应监测模式(Multi Reaction Monitoring，MRM)进行检测，并同时进行定性和定量的双离子通道分析，进而进一步提高该方法的准确性和专属性.

为了增强方法的灵敏度，本研究进行多时间段的多反应检测扫描(multi-period MRM，mpMRM)，即按照待测药物的保留时间，分为多个时间段分别进行MRM扫描，以增加每个药物的扫描时间，进而提高灵敏度.具体参数见表 1.

mpMRM数据采集模式在一个循环中可检测多个药物，能节约分析时间，此外，mpMRM数据采集模式在特定时间段内仅对1种或2种特定离子进行扫描，使该离子的扫描时间增加，灵敏度能够显著提高.

将用于检测的样品进行测定得到色谱图见图 1(图中数据1.23×10⁵、3.76×10⁵等表示峰面积大小).从图 1可以看出，23种药物能和其他色谱峰完全分离，空白样品没有干扰，达到了多药物同时检测的目的.

表 1(Table 1)

表 1 23种药物的mpMRM参数 Table 1 mpMRM parameter of twenty three kinds of drugs

表 1 23种药物的mpMRM参数 Table 1 mpMRM parameter of twenty three kinds of drugs

图 1(Fig.1)

图 1 23个药物的定量离子通道与定性离子通道色谱图 Fig.1 Chromatograms of twenty three kinds of drugs with quantitative and qualitative ion channels

准确量取适量的23个药物的标准溶液，分别添加到500 mL空白水样中，制得含量分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng · mL^-1的系列空白添加试样，按前处理方法项下所述方法进行处理，然后进行UPLC-MS/MS测定.对于磺胺和喹诺酮类药物，以各药物定量离子的色谱峰面积为纵坐标，样品浓度(ng · mL^-1)为横坐标，绘制标准曲线，并测定检出限(S/N>3)和定量限(S/N>10)，结果见表 2.对于β-受体激动剂类药物，按内标法以峰面积比计算.检测限、定量限及标准曲线的具体结果见表 2.

表 2(Table 2)

表 2 23种药物的标准曲线、定量限和检测限 Table 2 Standard equation，LODs and LOQs of twenty three kinds of drugs

表 2 23种药物的标准曲线、定量限和检测限 Table 2 Standard equation，LODs and LOQs of twenty three kinds of drugs 药物 标准曲线 r LOD/ (ng·mL-1) LOQ/ (ng·mL-1) 注：LOD表示检测限，LOQ表示定量限，Y为色谱峰面积，X为样品浓度(ng · mL-1). β-受体激动剂类药物 西马特罗 Y=0.494X-0.24 0.993 0.5 1.0 沙丁胺醇 Y=1.524X+0.076 0.998 0.5 1.0 莱克多巴胺 Y=1.104X+0.155 0.999 0.5 1.0 氯丙那林 Y=1.765X-0.430 0.998 0.5 1.0 克伦特罗 Y=0.61X-0.058 0.998 0.5 1.0 妥布特罗 Y=2.29X-0.633 0.998 0.5 1.0 喹诺酮类药物 培氟沙星 Y=486X-74.8 0.998 0.5 1.0 环丙沙星 Y=293X+7.55 0.999 0.5 1.0 氧氟沙星 Y=416X-8.11 0.999 0.5 1.0 吡哌酸 Y=282X-15.8 0.999 0.5 1.0 萘啶酸 Y=891X-87.4 0.999 0.5 1.0 洛美沙星 Y=418X-38.3 0.999 0.5 1.0 二氟沙星 Y=381X-25.6 0.999 0.5 1.0 磺胺类药物 磺胺邻二甲氧嘧啶 Y=426X-1.50 0.999 0.5 1.0 磺胺噻唑 Y=378X-18.9 0.998 0.5 1.0 磺胺吡啶 Y=321X-23.5 0.998 0.5 1.0 磺胺甲基嘧啶 Y=237X-25.0 0.999 0.5 1.0 磺胺二甲基唑 Y=386X-13.0 0.999 0.5 1.0 磺胺二甲嘧啶 Y=365X+1.05 0.998 0.5 1.0 磺胺甲噻二唑 Y=391X+1.48 0.997 0.5 1.0 磺胺甲唑 Y=211X+4.54 0.996 0.5 1.0 磺胺二甲异唑 Y=291X+10.2 0.998 0.5 1.0 磺胺二甲氧嘧啶 Y=359X-64.3 0.999 0.5 1.0

通过表 2数据可以看出，喹诺酮及磺胺类药物在1.0~100.0 ng · mL^-1的浓度范围内峰面积与药物浓度呈良好的线性关系，相关系数均大于0.996.对于β-受体激动剂类药物，按内标法以峰面积比计算，结果表明，6种β-受体激动剂类药物在1.0~100.0 ng · mL^-1的浓度范围内峰面积与药物浓度呈良好的线性关系，相关系数(r)均大于0.992.上述数据说明本检测方法灵敏度高，检测限和定量限较低.

准确量取适量的23个药物的标准液，配制高、中、低浓度的混合标准溶液，分别添加到500 mL空白水样中，按照样品前处理方法处理样品，并测定药物浓度，每个浓度测定6个样本，每个浓度的测得量与加入量相比，最终得到回收率.日内精密度按高、中、低3个浓度分别在1 d的不同时间测6次进行计算，日间精密度按高、中、低浓度连续测定3 d进行计算.

本方法的准确度在80%~110%之间，日内精密度在10%以下，日间精密度在12%以下，且大部分的日间精密度在10%以下.说明该方法准确度高，且重现性良好.

在北京地区规模化养殖厂厂区和周边地下水井内抽取了实际样品10份，并应用该方法进行测定，上述药物均未检出，但以样品为本底，添加浓度为1.0 ng · mL^-1时，回收率为85%.检测结果为阴性可能与北京地区规模化养殖中兽药使用规范有关.需要扩大采样范围，增加采样量，进一步对本方法进行验证.

结合HLB固相萃取富集净化技术和多时间段多反应监测的质谱扫描方法(mpMRM)，本研究建立了一种快速简便、专属性强、灵敏度高的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法，可在10 min内同时检测地下水中三大类兽用药物残留(10种磺胺类药物、7种喹诺酮类药物及6种β-受体激动剂药物).该方法在1.0~100.0 ng · mL^-1的浓度范围内峰面积与药物浓度呈良好的线性关系，相关系数均大于0.99，回收率和灵敏度高，是一个可用于地下水中药物残留的快速检测的好方法.