我国是一个占世界总人口20%以上的发展中大国，在工业化持续快速推进的过程中，交通运输、燃料燃烧、房屋建设、冶金炼钢等造成了严重的大气颗粒物污染.因此，大气颗粒物长期低浓度接触和污染事件所引发的健康问题显得尤为突出.大气可吸入颗粒物(PM₁₀)是指空气动力学直径≤10 μm、可在大气中长期悬浮的液体或固体悬浮物，不仅自身携带许多有毒有害物质，还可作为其它污染物的载体，通过呼吸作用进入呼吸道，沉积在支气管表面乃至肺泡中，对呼吸道具有腐蚀和刺激作用(李怡等，2007；Valavanidis et al., 2013).而近期越来越多的研究表明，颗粒物不仅会使居民呼吸系统疾病发生率增高，而且对心脑血管系统也将产生不良影响，特别是有相关结果提示，在大气颗粒物污染比较严重的地区，人群神经系统疾病的发病率显著增高(Maheswaran et al., 2005；Wellenius et al., 2005； Allen et al., 2014；von Bornstädt et al., 2014).

作为复合污染物，PM₁₀一般由各种无机盐类、有机化合物、微量元素、颗粒元素碳(PEC，有时也称为炭黑)及病原微生物等组成.研究表明，不同季节来源的颗粒物由于形成条件不同，其粒径分布、化学组成也不尽相同(Schwarze et al., 2006；Li et al., 2013)，即使是单个颗粒，也可能包含不同来源和不同种类的化合物.由于污染物的毒性效应与其物化特征密切相关，因此，不同季节PM₁₀毒性特征可能会随粒径分布和特征污染物的不同而变化，诱导神经元损伤可能也会有所差异.但到目前为止，相关研究还主要集中在流行病学领域，利用实验模型确定季节依赖性PM₁₀暴露诱导神经元损伤的分子靶标的研究还有待深入.为此，本研究通过建立原代培养皮层神经元体外染毒模型，考察PM₁₀暴露对炎性因子诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)和黏附分子(ICAM-1)表达水平的影响，并探讨与之耦联的磷酸化Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα(p-CaMKⅡα)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(p-CREB)及即早基因(c-jun、c-fos)表达情况，旨在为阐明PM₁₀诱导中枢神经系统损伤的分子机制提供实验依据.

新生24 h内的SPF级昆明小鼠乳鼠，由河北医科大学动物中心提供.DMEM购自HyClone公司；谷氨酸钠、L-谷氨酰胺、胰酶、Tween-20、SDS-PAGE电泳及细胞裂解液相关试剂均购自Amresco公司；Neuronbasal培养基和B27均购自GIBCO 公司；Insulin、Poly-L、牛血清蛋白(BSA)、考马斯亮蓝(G-250)均购自Sigma公司；胎牛血清购自四季青公司；一抗iNOS，ICAM-1，p-CaMKⅡα和p-CREB购自北京博奥森公司；一抗COX-2购自Cayman Chemical公司；一抗β-actin购自Cell Signaling Technology公司；二抗IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG(H+L)购自LI-COR公司.

用TH-150C型智能中流量采样器采集2011年3月1日—2012年2月21日(每个季节2个月)1年内山西大学生活区(112°57′E，37°73′N)大气中PM₁₀，流量为100 L · min^-1，每天采样24 h，同时记录采样前后玻璃纤维滤膜的重量.采集完成后，将滤膜密封在铝箔中，4 ℃储藏备用.实验前将载有颗粒物的滤膜剪成1 cm²的小块于烧杯中，加入适量的超纯水置于超声振荡器上反复振荡3次，每次20 min，同时加冰以保证水温在20 ℃以下，振荡结束后用6层纱布过滤，收集滤液，进行真空冷冻干燥，收集不同季节的PM₁₀.

用75%的酒精擦拭乳鼠进行消毒，断头处死后立即取脑并迅速剥离大脑皮层，将其放入预冷的DMEM中，除去血膜并将大脑皮层剪碎.将组织碎块移至37 ℃胰酶中孵育10 min，用含10%小牛血清的DMEM将胰酶洗净，吹打组织块解离神经元，1000 r · min^-1离心10 min.用含谷氨酸钠的Neuronbasal/B27培养基重悬细胞并将其稀释到所需浓度.将细胞悬液铺至预先用Poly-L处理过的35 mm培养皿中(细胞密度5×10⁵个 · mL^-1)，于CO₂培养箱(Thermo，美国)中37 ℃培养.每3 d换液1次，每次换液1/2~1/3体积培养液(无谷氨酸钠).细胞随机分为5组，每组3个平行样，对照组在Neuronbasal/B27培养基环境中进行培养，其余4组染毒组分别用100 μg · mL^-1的不同季节PM₁₀悬液进行处理，处理时间为24 h.PM₁₀悬液需在染毒前用Neuronbasal/B27培养基配置.染毒结束后，收集细胞蛋白用于实验分析.

将培养基移走，用预冷的PBS(pH=7.4)洗细胞2次，风干，加入100 μL细胞裂解液(含1% Nonidet P40、1 mmol · L^-1 EDTA、8 mmol · L^-1 EGTA、2.5 μg · mL^-1 aprotinin、5 μg · mL^-1 pepstatin、50 μg · mL^-1 leupeptin、25 μmol · L^-1 PMSF、8 mmol · L^-1 DDT和25 μg · mL^-1Trypsin inhibitor)浸润，用细胞铲刮下细胞，将白色絮状物和裂解液移入2 mL离心管中.用1 mL注射器抽吸混合液数次将长链蛋白质打断，置于冰上孵育20 min.然后于4 ℃下13000 r · min^-1离心20 min，取上清，BSA做标准曲线，用考马斯亮蓝法检测样品蛋白含量.95 ℃金属浴中煮样5 min，使蛋白变性，瞬离分装并置于-20 ℃保存备用.取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至硝酸纤维膜上，以含5% 脱脂奶粉的封闭液封闭1.5 h.加入已稀释至适当浓度的一抗，4 ℃摇床过夜，PBST(0.1% Tween-20)洗膜3次，每次10 min.加入已稀释为1 ∶ 5000的二抗，室温孵育1.5 h，PBST洗膜3次，每次10 min.用近红外双色激光成像系统Odyssey(LI-COR，美国)进行扫膜，并用凝胶图像处理系统分析目标条带的光密度值.结果用目的蛋白与β-actin的比值来表示.

用SPSS17.0统计软件对数据进行统计分析.用One-way ANOVA法中的Dunnett′s post hoc test检验染毒组与对照组的差异显著性(^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001).

图 1结果表明，PM₁₀暴露选择性诱导神经元炎性因子释放增加，且效应呈现季节依赖性变化.其中，iNOS蛋白表达略呈上升趋势，最高达到对照组的1.28倍；COX-2和ICAM-1的蛋白表达水平明显升高，不同季节PM₁₀暴露均可诱导统计学变化，但冬季效应最为明显，可分别达到对照组的1.42和1.83倍(p<0.01，n=3).

图 1(Fig.1)

图 1 不同季节PM10暴露对原代神经元炎性因子蛋白表达的影响(n=3) Fig.1 Quantifications of inflammatory cytokine expression in primary cultured neurons after season-dependent PM10 exposure(n=3)

由图 2结果可以看出，不同季节的PM₁₀处理均可诱导CaMKⅡα蛋白磷酸化水平上调，除秋季外均呈现出统计学差异，最高可达到对照组的1.28倍(p<0.05，n=3).而CREB的蛋白磷酸化水平呈现明显的季节依赖性变化，以秋、冬两季最为明显，可分别达到对照组的1.47倍(p<0.001，n=3)和1.66倍(p<0.001，n=3).

图 2(Fig.2)

图 2 不同季节PM10暴露对原代神经元CaMKⅡα和CREB蛋白磷酸化水平的影响(n=3) Fig.2 Quantifications of p-CaMKⅡα and p-CREB expression in primary cultured neurons after season-dependent PM10 exposure(n=3)

图 3结果显示，不同季节PM₁₀暴露显著上调c-jun和c-fos蛋白表达，且呈现季节依赖性变化.冬季PM₁₀处理后c-jun的变化最为明显，达到对照组的1.63倍(p<0.01，n=3)；c-fos表达变化仅在秋、冬两季呈现出统计学差异，分别达到对照组的1.42和1.62倍(p<0.05，n=3).

图 3(Fig.3)

图 3 不同季节PM10暴露对原代神经元c-jun和c-fos蛋白表达的影响(n=3) Fig.3 Quantifications of c-jun and c-fos expression in primary cultured neurons after season-dependent PM10 exposure(n=3)

2013年以来，我国中东部地区连续出现多次大范围雾霾天气，雾霾的面积达130万km².颗粒物是城市灰霾的“元凶”，其不仅可直接进入肺部，还能进入肺泡甚至血液，引起肺部和全身炎症，影响人体的呼吸、心血管、免疫、生育和神经系统，严重危害健康.在目前报道的颗粒物诱导机体神经系统损伤机制中，炎症反应备受关注.PM₁₀中的某些成分如纳米级颗粒物及附着的金属等可以通过呼吸进入嗅球，从而通过嗅觉神经系统转运进入中枢神经系统，刺激神经元细胞分泌炎性因子(Campbell et al., 2005)；而PM₁₀中的其他粒径成分主要通过增加肺部促炎症因子的表达引发呼吸道炎症，进而引发全身炎性反应(Block et al., 2009).炎症反应可导致炎性细胞在毛细血管中的聚集、浸润，损伤内皮细胞，破坏血脑脊液屏障(Block et al., 2009)，并激活炎症级联反应，包括谷氨酸堆积、钙离子超载和自由基的呼吸爆破，进而造成脑组织损伤(Chock et al., 2005).iNOS、COX-2和ICAM-1是参与上述炎症反应的几种主要因子.iNOS主要存在于白细胞等炎症细胞中，正常生理情况下，各组织细胞的iNOS活性几乎不表达，病理状况下受细胞因子等多种刺激因素诱导而大量表达，引起一氧化氮(NO)合成增加，干扰细胞正常代谢(王菊勇等，2012).COX-2主要位于细胞浆内及细胞核周，属于诱导酶，正常组织内检测不到，主要表达于组织损伤后的炎症细胞中，参与多种疾病发生发展的病理过程(Aïd et al., 2011).ICAM-1是黏性分子中较具代表性的一种，其表达上调可促进炎性细胞向受损组织部位的迁移和浸润，血管内皮表面形成牢固粘附，恶化炎症反应(Li et al., 2007).本研究结果表明，原代神经元暴露于不同季节PM₁₀后，iNOS、COX-2和ICAM-1表达均呈现出不同程度的增加，且效应呈现季节性差异.这可能是由于PM₁₀暴露刺激了促炎因子(如肿瘤坏死因子TNF-α和白细胞介素1 IL-1β)表达(Guerra et al., 2013)，进而促进iNOS、COX-2等诱导酶的表达和组胺等的释放，激活补体、内皮细胞和中性粒细胞等，与此同时，ICAM-1在炎性细胞因子的刺激下高表达，介导白细胞的粘附和渗出，引发炎症级联反应(Guo et al., 2012).

广泛分布于神经元中的 CaMKⅡ，作为“记忆”分子，可以直接被炎性诱导的Ca²⁺过载激活，进而使得下游效应蛋白的磷酸化成为可能，其中能被多种激酶磷酸化的特征目标就是转录因子CREB(寿天德，2006).CREB是细胞内多种信号通路的重要组成部分，作为蛋白激酶A(PKA)、CaMKs等的磷酸化底物，其生物活性可以通过Ser-133位点的磷酸化被激活或者抑制(Gao et al., 2011；Malberg et al., 2005).即早基因c-jun和c-fos可以被磷酸化的CREB所激活(Miyamoto，2006)，通过参与信号传递影响晚期靶基因的表达(桑楠等，2008).本实验结果表明，PM₁₀暴露刺激炎性因子释放，造成钙离子内流(桑楠等，2008)，胞内过多的钙离子与钙调蛋白(CaM)形成Ca²⁺/CaM复合物，引起CaMKⅡα亚基Thr286位点磷酸化，刺激下游CREB磷酸化水平升高(Ding et al., 2013)，启动即早基因表达(Cortés-Mendoza et al., 2013)，最终导致神经元损伤.此外，冬季属于采暖期，PM₁₀理化成分中多环芳烃类物质负荷较高(Teixeira et al., 2013；Rogula-Kozlowska et al., 2014)，这可能是引发神经元炎性和Ca²⁺-CaMK-CREB级联损伤效应季节性差异的主要原因.

不同季节PM₁₀暴露刺激原代培养神经元炎性因子(iNOS、COX-2和ICAM-1)释放增加，显著上调p-CaMKⅡα和p-CREB的水平，并刺激即早基因(c-jun和c-fos)的高表达；上述作用呈现季节依赖性变化，以冬季的效应最为明显.由此提示，PM₁₀暴露可能通过炎症反应机制启动Ca²⁺-CaMK-CREB通路，进而刺激即早基因表达引发神经毒性作用，而冬季高负荷的多环芳烃类物质可能是造成效应季节性差异的主要原因.