抗生素被大量用于人类和动物的疾病治疗，同时，以亚治疗剂量长期添加于动物饲料中预防疾病和促进动物生长，在保障人类健康和促进畜牧业发展方面起到了重要作用.但随着抗生素的大规模使用，造成的环境危害日渐显露.据2000年美国地质调查所在全美国范围内139条河流调查，在所有样本中检测到16种抗生素化合物，而在其他地表和地下饮用水源中也检测到至少6种低浓度的抗生素(Kolpin et al., 2002; 俞道进等，2004).我国江苏地区畜禽养殖场粪便的调查发现，其中普遍存在磺胺类抗生素的残留.对浙北地区畜禽粪便样和施用畜禽粪肥的农田土壤调查也表明，施用畜禽粪肥的农田表层土壤中，土霉素、四环素和金霉素的检出率分别为93%、88%和93%.残留的抗生素随动物粪便施肥进入土壤后，被植物吸收积累，并破坏植物根际周围的微生态平衡；随粪便或地表径流进入水体，将对水体中的微生物产生毒性效应，破坏微生物生态结构；环境中残留的抗生素将会导致微生物的耐药性增强以及强耐药性细菌的产生，甚至诱导产生耐药性基因，而细菌的耐药性基因还会在同类细菌中转移(谭为军和胡真虎，2011).

近些年，我国抗生素每年消费总额的50%～70%被用于畜牧业，磺胺类药物是兽药抗生素中使用最广泛的品种之一，在欧洲磺胺类药物是使用量第2大的兽药抗生素，2000年时磺胺类药物在英国的销量占兽药抗生素总销售量的21%，在其他几个欧洲国家亦达到11%～23%(Sarmah et al., 2006;秦国建等，2011；王云鹏和马越，2008).兽用磺胺类药物的大量使用，在进入动物体内后，大部分(约使用量的60%～90%)不能被机体吸收，随动物粪尿排出，不断进入环境，含有兽药残留的动物粪尿作为有机肥施入农田造成土壤污染，并对土壤生态系统产生不良影响(邰义萍等，2011；王惠惠和王淑平，2011；Martínez-Carballo et al., 2007;王冉等，2006；刁晓平等，2004；张学飞等，2004；张健等，2011).研究磺胺类药物在环境中的降解转化规律，对准确有效地评估磺胺类药物的环境风险有重要意义.

目前，磺胺类药物在土壤环境中残留、降解研究大多是采用在土壤或粪便单一基质中进行的研究(金彩霞等，2011；文春波等，2007；王辉等，2009)，如国彬等研究了磺胺甲恶唑和磺胺二甲嘧啶在土壤中的含量总体呈随培养时间而不断下降趋势，且磺胺甲恶唑的降解速率大于磺胺二甲嘧啶(国彬等，2012)；张健等研究了鸡粪中金霉素、土霉素和四环素3种抗生素在棕壤中含量的动态变化规律及消解途径，发现鸡粪中所含的3 种四环素类抗生素在棕壤中的含量均表现为前期迅速下降，中后期逐渐平稳的这一降解规律(张健等，2011).未考虑到兽药抗生素进入土壤是通过畜禽粪便(有机肥主要原料)的农业利用这一主要途径(沈德龙等，2007；黄鸿翔等，2006；陈杖榴，2005)，以及磺胺类药物在环境中的主要存留介质是粪便与土壤混合物，因此，本文选用了5种使用量较大的兽用磺胺类药物作为研究主体，模拟有机肥源磺胺类药物施入农田后，对在不同类型土壤中的降解动态规律进行探究，并与未加粪便土壤中的降解性进行比较，分析粪便的加入对磺胺类药物降解性的影响，以及光照作用对其降解速率的影响，以期为我国兽药抗生素的环境风险评价提供有效技术支撑.

供试药物选用5种典型磺胺类药物，其信息见表 1.

表1(Table 1)

表1 供试药物信息 Table 1 Basic properties of the tested sulfonamides

表1 供试药物信息 Table 1 Basic properties of the tested sulfonamides 药物名称 结构式 纯度 来源 注: 内标物质为氘代磺胺甲恶唑-d4(纯度98.0%，sulfamethoxazole-d4，SMX-d4)，购于多伦多研究化学品公司(North York，Ontario). 磺胺嘧啶 (sulfadiazine，SDZ) 99.0% 美国Sigma公司 磺胺甲嘧啶 (sulfamerazine， SMZ) 99.2% 美国Sigma公司 磺胺二甲嘧啶 (sulfamethazine， SMT) 99.0% 美国Sigma公司 磺胺二甲氧嘧啶 (sulfadimethazine， SDM) 99.0% 美国Sigma公司 磺胺甲恶唑 (sulfamethoxazole， SMX) 99.0% 美国Sigma公司

供试土壤分别选择江西红壤、太湖水稻土、东北黑土3种，土壤均采自未受污染的洁净土壤，0～20 cm耕作层，经风干，研碎，过20目筛，备用，其基本理化性质见表 2.

表2(Table 2)

表2 供试土壤的基本理化性质 Table 2 Physical and chemical properties of soils tested

表2 供试土壤的基本理化性质 Table 2 Physical and chemical properties of soils tested 土壤类型 pH 有机质含量/ (g·kg-1) 阳离子代换量/ (cmol(+)·kg-1) <0.01mm 黏粒含量 红壤 5.29 9.94 10.60 35.6% 水稻土 6.23 12.60 17.40 15.9% 黑土 7.86 17.00 29.76 21.2%

供试猪粪采自江苏省农业科学研究院养猪场的小猪仔粪便，经冷冻干燥仪冻干后，研碎至细碎粉末，待用.基本理化性质为：pH 8.03，有机质含量60.7%，总磷2.40%，总氮2.04%.通过超高效液相色谱-质谱-质谱检测，粪便中未检出磺胺类药物残留.土壤-粪便混合基质即将土壤与粪便以质量比1 : 0.04的比例进行混合(Sukul et al., 2008).

供试仪器: ACQUITYTM超高效液相色谱仪-Quattro Premier XE质谱仪(UPLC-MS/MS，Waters 公司，美国)；真空冷冻干燥机(Virtis公司，美国)；RXZ型智能人工气候箱(宁波江南仪器厂，中国)；300型加速溶剂萃取仪(Dionex公司，美国)；CR 22GⅡ离心机(HITACHI，日本)；R-210旋转蒸发仪(BUCHI公司，瑞士).

供试试剂:硫酸、氨水、无水硫酸钠(均为分析纯，南京化学试剂有限公司，中国)；甲醇、丙酮、乙腈(均为色谱纯，Merck 公司，德国)；硅藻土(10～20目，Dionex公司，美国).

预培养：分别称取 20.0 g 上述3种供试土壤于150 mL三角烧瓶中，每种土壤称取3组，加水至40%饱和持水量，于室温(25 ℃)条件下，避光培养2周.

取3种培养后土壤各1组，添加磺胺类药物实验液(丙酮液)至土壤浓度为1.00 mg · kg^-1，混匀，通风橱中通风挥发干有机溶剂，加水调节土壤水分至饱和持水量的60%，用透气硅胶塞将瓶口塞紧，定期检查并补充水分保持土壤持水状态.置于人工气候箱中于(25±1)℃、湿度75%～85%、避光条件下培养.按0、6、10、15、20、60、90、120、150、180 d时间间隔定期采样，测定土壤中药物残留浓度.

取3种培养后土壤各一组，分别加入0.8 g 粪便混于土壤中，均匀、准确地滴加磺胺类药物试验液(丙酮液)，添加浓度为1.00 mg · kg^-1，通风橱中通风挥发干有机溶剂，混匀，加水调节土壤水分至饱和持水量的60%，用透气硅胶塞将瓶口塞紧，定期检查并补充水分保持土壤持水状态.置于人工气候箱中于(25 ±1)℃、湿度75%～85%、避光条件下培养.按一定时间间隔定期取样(0、6、10、15、20、60、90、120、150、180 d)，测定土壤中药物残留浓度.

取3种培养后土壤各一组，分别加入0.8 g 粪便混于土壤中，均匀、准确地滴加磺胺类药物试验液(丙酮液)，添加浓度为1.00 mg · kg^-1，通风橱中通风挥发干有机溶剂，混匀，加水调节土壤水分至饱和持水量的60%，用透气硅胶塞将瓶口塞紧，定期检查并补充水分保持土壤持水状态.置于人工气候箱中于(25 ± 1)℃、湿度75%～85%、光照(12 h光照，光照强度1041 lx；12 h避光)条件下培养.按一定时间间隔定期取样(0、6、10、15、20、60、90、120、150、180 d)，测定土壤中药物残留浓度.

提取：所采样品(20.0 g 土壤或20.0 g 土壤+0.8 g 粪便)加入8 g硅藻土混合、干燥后，装入33 mL的ASE萃取池，使用加速溶剂萃取(ASE)系统，压力设为1500 psi，温度80 ℃，保持10 min，60%的冲洗体积，冲洗60 s.每个土壤样品均用甲醇/丙酮(50/50，V/V)循环提取2次，合并提取液，待下一步净化处理.

净化：提取液旋转蒸发浓缩至2 mL，加入超纯水稀释至有机相比例小于5%.用4 mol · L^-1硫酸调节pH值为4，用Oasis HLB固相萃取小柱对溶液中待测物进行富集净化.用6 mL甲醇、6 mL超纯水活化小柱，上样速度约为3~4 mL · min^-1.接着，用10 mL的超纯水淋洗HLB小柱，并在真空条件下干燥30 min，用2 mL的2%氨水/甲醇洗脱两次，洗脱液氮气吹干，然后用20%甲醇/水定容至1 mL，涡旋振荡1 min，过0.22 μm微孔滤膜，待UPLC-MS/MS进行分析.

超高效液相色谱条件: ACQUITY UPLC BEH C18 柱，1.7 μm，2.1 mm×50 mm，Waters；流动相A：乙腈，B：0.1% 甲酸/水，V/V，梯度洗脱条件见表 3；流速0.1 mL · min^-1；进样量5 μL.

表3(Table 3)

表3 流动相梯度洗脱条件 Table 3 Gradient elution conditions of mobile phases

表3 流动相梯度洗脱条件 Table 3 Gradient elution conditions of mobile phases 时间/min 流速/ (mL·min-1) A B 0 0.1 4% 96% 3 0.1 10% 90% 8 0.1 20% 80% 12 0.1 40% 60% 16 0.1 20% 80% 16.1 0.1 4% 96% 20 0.1 4% 96%

质谱条件：电喷雾离子源(ESI);离子源温度为120 ℃；脱溶剂温度为350 ℃;脱溶剂气和锥孔气为氮气;碰撞气为高纯氩气；脱溶剂气流速为600 L · h^-1;锥孔气流速为50 L · h^-1；采用多反应监测模式(MRM)检测；质谱采集参数见表 4.

表4(Table 4)

表4 磺胺类药物的质谱检测条件 Table 4 Mass-spectrometric detection conditions of sulfonamides

表4 磺胺类药物的质谱检测条件 Table 4 Mass-spectrometric detection conditions of sulfonamides 名称 定性离子对 (m/z) 定量离子对 (m/z) 锥孔 电压/ V 碰撞能量 (CE)/V 磺胺嘧啶 250.88 > 107.84 250.68 > 155.78 30 15/20 磺胺甲嘧啶 264.92 > 171.74 264.92 > 155.78 30 15/20 磺胺二甲嘧啶 278.89 > 91.89 278.94 > 185.82 25 15/25 磺胺二甲氧嘧啶 309.42 > 91.97 311.10 > 155.81 25 20/30 磺胺甲恶唑 309.42 > 91.91 253.95 > 155.79 25 15/20

质量控制：5种磺胺类抗生素在供试土壤中的加标回收率为磺胺嘧啶81.7%～84.6%，磺胺甲嘧啶81.2%～85.9%，磺胺二甲嘧啶82.1%～85.3%，磺胺二甲氧嘧啶81.5%～86.1%，磺胺甲恶唑82.0%～85.8%，均符合兽药环境试验要求

所有试验数据均采用 Sigma plot 10.0统计软件进行处理分析.本类磺胺类药物在土壤中的降解规律遵循二次指数函数，可用下列公式表达(Beulke and Brown， 2001; Blackwell et al., 2007)：

采用室内模拟法，在25 ℃恒温避光条件下，5种磺胺类药物在江西红壤、太湖水稻土和东北黑土中的降解试验结果见表 5.

表5(Table 5)

表5 避光条件下不同土壤中降解特性参数 Table 5 Degradation parameters in different types of soils in dark

表5 避光条件下不同土壤中降解特性参数 Table 5 Degradation parameters in different types of soils in dark 药名 土壤类型 二级指数方程 可决系数R2 DT50/d DT90/d 磺胺嘧啶 江西红壤 C＝0.4692e-0.0063t-0.5101e-0.0063t 0.945 110 ＞180 太湖水稻土 C＝0.5179e-0.1007t-0.4907e-0.1007t 0.965 7.00 22.7 东北黑土 C＝0.4871e-0.1023t-0.4591e-0.1023t 0.980 6.50 22.5 磺胺甲嘧啶 江西红壤 C＝0.2085e-0.2456t-0.7224e-0.0071t 0.969 62.0 ＞180 太湖水稻土 C＝0.7784e-0.0951t-0.1795e-0.0071t 0.987 10.1 89.3 东北黑土 C＝0.4631e-0.0863t-0.4368e-0.0863t 0.956 7.73 26.7 磺胺二甲嘧啶 江西红壤 C＝0.2917e-0.1812t-0.6533e-0.0020t 0.969 160 ＞180 太湖水稻土 C＝0.6262e-0.0742t-0.3460e-0.008t 0.965 18.0 163 东北黑土 C＝0.8458e-0.0865t-0.1711e-0.0039t 0.981 10.9 142 磺胺二甲氧嘧啶 江西红壤 C＝0.4737e-0.0595t-0.3641e-0.0011t 0.961 37.4 ＞180 太湖水稻土 C＝0.6519e-0.0996t-0.3799e-0.0077t 0.976 14.3 173 东北黑土 C＝0.7154e-0.0977t-0.4060e-0.0045t 0.980 14.8 ＞180 磺胺甲恶唑 江西红壤 C＝0.2544e-0.0652t-0.6833e-0.0007t 0.946 ＞180 ＞180 太湖水稻土 C＝0.7773e-0.0849t-0.1323e-0.0029t 0.981 10.0 134 东北黑土 C＝0.8976e-0.0719t-0.1461e-0.0014t 0.943 8.60 ＞180

由此可见，避光条件下，5种磺胺类药物在江西红壤中均具有较强的稳定性，磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺甲恶唑的降解半衰期分别为110、62、160、37.4、>180 d，90%降解量所需时间均大于180 d；在太湖水稻土和东北黑土中，磺胺类药物的降解半衰期均较短，处于3.9～18 d之间，但其90%降解量所需时间较长，最长为180 d以上.

避光条件下，有机肥(猪粪)源磺胺类药物在不同土壤中的降解试验结果见表 6，并结合上述其在不同单一土壤中的降解动态进行比较分析，探寻磺胺类药物在不同基质中行为归趋的差异.其结果见图 1.

表6(Table 6)

表6 避光条件下不同土壤混合基质中降解特性参数 Table 6 Degradation parameters in different mixtures of materials in dark

表6 避光条件下不同土壤混合基质中降解特性参数 Table 6 Degradation parameters in different mixtures of materials in dark 药名 基质类型 二级指数方程 可决系数R2 DT50/d DT90/d 磺胺嘧啶 江西红壤+粪便 C＝0.6059e-0.1237t-0.5631e-0.1237t 0.944 6.00 18.6 太湖水稻土+粪便 C＝0.7029e-0.2429t-0.1058e-0.0082t 0.981 3.50 34.0 东北黑土+粪便 C＝0.8057e-0.2150t-0.1217e-0.0107t 0.996 4.10 28.0 磺胺甲嘧啶 江西红壤+粪便 C＝1.0326e-0.1011t-0.1362e-0.0028t 0.934 8.40 65.5 太湖水稻土+粪便 C＝0.8042e-0.2809t-0.1991e-0.0106t 0.997 3.29 64.6 东北黑土+粪便 C＝0.6567e-0.2370t-0.2497e-0.0121t 0.984 4.50 84.2 磺胺二甲嘧啶 江西红壤+粪便 C＝0.8731e-0.1157t-0.1582e-0.0024t 0.9883 7.55 >180 太湖水稻土+粪便 C＝0.4487e-0.1207t-0.4105e-0.0076t 0.9926 15.2 >180 东北黑土+粪便 C＝0.6262e-0.0742t-0.3460e-0.0080t 0.953 5.84 172 磺胺二甲氧嘧啶 江西红壤+粪便 C＝0.9172e-0.1388t-0.0850e-0.0017t 0.915 5.84 28.8 太湖水稻土+粪便 C＝0.7734e-0.1939t-0.1977e-0.0086t 0.929 5.47 84.4 东北黑土+粪便 C＝0.7289e-0.1162t-0.1149e-0.0038t 0.973 7.81 87.5 磺胺甲恶唑 江西红壤+粪便 C＝0.7425e-0.1448t-0.1215e-0.0062t 0.985 5.84 57.8 太湖水稻土+粪便 ＜3.0 27.1 东北黑土+粪便 ＜3.0 17.8

图 1(Fig. 1)

图 1 避光条件下5种磺胺类药物在不同试验基质中的降解动态 Fig. 1 Degradation dynamics of Sulfonamides in different test materials in dark

由上述结果可见，5种兽用磺胺类抗生素在不同土壤和土壤-粪便中的降解规律均能较好地用二级指数函数方程描述，其降解规律呈“L”型曲线.磺胺类药物在土壤粪便混合基质中的降解速率均明显高于单一土壤中样品，尤其是江西红壤-粪便混合基质中的降解速率加快最为显著，降解半衰期分别为6.00、8.40、7.55、5.84、5.84 d(见表 6).另外5种磺胺类药物中，磺胺甲恶唑的降解速率变化最大，其在江西红壤、太湖水稻土和东北黑土中的DT₅₀分别为>180、10.0、8.6 d(见表 5)，加入粪便后的混合基质中DT₅₀分别为5.84 d(江西红壤-粪便)、<1.0 d(太湖水稻土-粪便)、<1.0 d(东北黑土-粪便)(见表 6).

有机肥源磺胺类药物进入土壤，常受到阳光的照射.本试验模拟了自然光照(光照强度为1041 lx，12 h光照+12 h避光)条件下，磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺甲恶唑在江西红壤-粪便混合基质中的降解性，其DT₅₀分别为6.02、8.40、7.50、5.00、4.92 d，DT₉₀分别为19.7、96.3、97.0、39.4、24.6 d.试验至180 d时，磺胺类抗生素在江西红壤中不同处理下的降解率见图 2.

图 2(Fig. 2)

图 2 不同处理下5种磺胺类药物在江西红壤中的降解动态 Fig. 2 Degradation dynamics of Sulfonamides in Jiangxi red soil with various treatments

由图 2可看出，在避光条件下，5种磺胺类抗生素在江西红壤中降解率最低，分别为76.2%、81.8%、52.5%、63.0%、34.6%，江西红壤+粪便混合基质中其降解率有显著提高，分别为97.1%、98.2%、92.7%、95.5%、98.0%；在光照条件下，江西红壤-粪便中的降解率分别为98.1%、95.9%、94.5%、97.0%、98.8%，较避光条件下江西红壤-粪便中降解率略有提高，但相差不大.

抗生素在土壤中的降解是个复杂的过程，在该过程中，药物与土壤相互作用，受土壤类型、抗生素种类等因素的影响.本试验采用室内模拟降解试验法，在江西红壤、太湖水稻土和东北黑土3种不同类型土壤中对5 种磺胺类抗生素进行土壤降解试验，结果显示，磺胺类抗生素在不同土壤类型中的降解速率排序为：东北黑土≈太湖水稻土>江西红壤，其在不同土壤类型中的降解速率均较慢，但在江西红壤中的降解速率最慢，这与江西红壤的理化性质相关，因其黏粒含量较高，药物在其土壤中吸附性增强，易与土壤结合，不利于降解转化，同时土壤有机质含量较低影响土壤微生物的活性，继而影响药物在土壤中的生物降解速率；5种磺胺类抗生素在江西红壤中的降解速率顺序为：磺胺甲嘧啶>磺胺嘧啶>磺胺二甲氧嘧啶>磺胺二甲嘧啶>磺胺甲恶唑.降解趋势主要呈现前段部分降解较快而后段部分降解缓慢，这一结果与Blackwell等对兽药抗生素在砂壤土中消解与迁移研究结果相一致(Blackwell et al., 2007)，主要是取决于磺胺类抗生素本身抑菌性强弱和在土壤中稳定性相关，同时，不同土壤类型、不同药物对土壤菌群抑制作用表现出时间差异，导致磺胺类药物降解速率变缓的时间有所差异(刁晓平等，2005).磺胺类抗生素在壤土和松沙土中开始阶段降解较快，主要原因可能是壤土和松沙土有机质含量较高，有助于磺胺类药物的降解，而在随后阶段降解速率缓慢，主要原因可能是磺胺类药物经过一段时间作用具有了其抑菌性(张从良等，2007).

抗生素在土壤中的降解途径主要包括微生物降解、化学降解和光降解等.本试验结果显示，土壤中粪便的加入对磺胺类药物的降解性产生了较大影响，土壤加入粪便后，其有机质含量增大，促进了降解微生物的生长，进而加快了磺胺类药物在混合基质中的降解速率.同时这一结果证明了微生物降解作用是磺胺类药物土壤降解中的降解主导线.但因磺胺类药物自身的抑菌性，其在降解后程阶段降解速率均有所减缓，与单一土壤中降解趋势一致，呈现先快后缓两个降解速率阶段.

通过避光与光照条件下5种磺胺类药物在江西红壤-粪便中降解速率的对比发现，光照条件对土壤降解速率有一定促进作用，但并不显著，这说明在江西红壤-粪便混合基质中磺胺嘧啶等5种抗生素的光化学降解作用有发生，但与其微生物降解作用相比比重较小.

1)在本试验条件下，5种兽用磺胺类抗生素在不同土壤类型中的降解规律呈“L”型曲线.在不同土壤类型中的降解速率排序为：东北黑土≈太湖水稻土>江西红壤，5种磺胺类抗生素在江西红壤中的降解速率顺序为：磺胺甲嘧啶>磺胺嘧啶>磺胺二甲氧嘧啶>磺胺二甲嘧啶>磺胺甲恶唑.抗生素的种类和土壤类型影响其降解速率，且因其“L”型降解规律，药物在土壤中滞留期长，完全消解需要较长时间.

2)磺胺类药物在不同混合基质中的降解速率比单一土壤基质中的降解速率快，粪便的加入，提高了原土壤中有机质含量，促进了磺胺类药物在土壤中的降解，说明了外源微生物的降解作用是磺胺类药物在土壤降解的主要转化途径.

3)磺胺类药物在土壤中的降解速率受光照影响.光照下，磺胺类药物的降解半衰期不同程度的缩短，土壤降解过程中发生了一定程度的光降解作用.但与外源微生物的降解作用相比，光解作用较弱.