自20世纪50年代我国铀矿冶工业兴起至今，铀尾矿已给人类生存环境造成了极大的威胁，因此，其处置问题始终是铀矿冶工业面临的重大难题.据不完全统计，全世界的铀尾矿总量已达200亿t(王志章，2009；刘振昊等，2012)，当铀尾矿库因服务期满或其他原因永久停止使用时，必须对铀尾矿库进行一系列的环境治理.植物修复技术是一种成本低廉、安全环保、易于被公众接受的修复方法，因此，该技术已成为目前最具潜力的修复铀尾矿的方式(姚介等，2010).

植物修复技术的关键是选取合适的用于修复的植物，通常是一些具有“特异功能”的植物，主要包括两类：一类是超富集植物，它们对污染物的富集具有专一性，一般生物量较低、生长缓慢；另一类是从污染地原位筛选出来的优势植物，它们生长快速、生物量大，对多种污染物都具有相对较好的富集效果(申时立等，2013).美洲商陆(Phytolacca Americana L.)属于第二类植物，它是多年生草本植物，在许多矿区的植被调查中都有报道(黄德娟等，2012;薛亮，2013).吴彦琼等(2010)在我国华南某铀尾矿库区的植物组成及多样性调查中发现，草本层美洲商陆占优势，但目前关于美洲商陆对铀富集效果的研究却鲜有报道.此外，植物根际微生物在植物修复中发挥着极为重要的作用，一方面它能增加污染物的生物可利用性，促进污染物由根向茎叶输送；另一方面，可将土壤根际的污染物固定，减少污染物向地下水的迁移和淋溶(Treey et al.，1999; Wei et al., 2014).因此，研究铀胁迫下植物根际微生物群落的变化，有助于阐明植物修复生态系统的稳定性.

基于此，本文依托西南科技大学材料环境降解及安全性评价试验场，模拟不同程度的铀污染情况，探究美洲商陆对铀的富集特点及根际微生物群落变化情况，以期为评估大生物量优势植物修复铀尾矿的可行性及生态系统的稳定性提供数据参考.

土壤采自西南科技大学材料环境降解及安全评价试验场(东经104°42′，北纬31°32′)，土壤类型为暗棕壤，有机质含量22.8 g · kg^-1，全氮1.50 g · kg^-1，全磷0.562 g · kg^-1，全钾25.4 g · kg^-1，碱解氮109 mg · kg^-1，有效磷9 mg · kg^-1，速效钾131 mg · kg^-1，阳离子交换量9.34 cmol · kg^-1.试验于2012年10月开始，采用盆(盆高25 cm，直径20 cm)栽方式，每盆装土2 kg.土壤处理方法：采取向目标土壤中添加外源污染物的形式，同时测定土壤含水量用以计算添加铀(U)的量，将铀溶液与干净土壤充分混匀(达最大持水量)而成，3个铀剂量分别为25、50、100 mg · kg^-1，处理编号依次为U25、U50、U100，用等体积清水处理作对照(CK).每个处理3个重复，预培养6个月.2013年5月种植美洲商陆，每盆定植3株，培养初期，每天傍晚浇水1次，旺盛生长期，早晚各浇1水次.

2013年8月(美洲商陆成熟期)采集美洲商陆根际土壤样品和植物样品.首先采集植物地上部分，装入植物样品袋后带回实验室，然后用直径5 cm的环割刀沿美洲商陆根垂直插入土层，取出环割刀，擦除外壁附着的土壤，轻轻敲打环割刀，将取出的土壤样品装入无菌塑料袋，取出的根装入植物样品袋带回实验室.植物样品带回实验室后立即进行测量；根际土壤混匀，过2 mm筛后置于冰箱内4 ℃保存，于7 d内测定微生物功能多样性.

用游标卡尺测量植物样品的株高和茎粗，测定距顶端第4片叶子大小(叶长和叶宽)，统计植物学性状；用自来水冲洗植物样品，再用去离子水冲洗3次，沥干，计算生物量.

植物样品分根、茎和叶3部分，在105 ℃下杀青20 min，80 ℃烘干至恒重，研磨粉碎，准确称取0.3 g，加入7 mL浓硝酸和2 mL 30%双氧水，于微波消解仪中消解，用ICP-MS(Agilent 7700x，美国安捷伦公司)测定各部位的铀含量.铀的富集量F按以下公式计算(唐永金等，2011)：

式中，C为单位植物干重的铀含量(μg · g^-1或mg · kg^-1)，D为植物干重(g或kg).

采用ECO微平板(Biolog公司)，每个样品测试31种碳源(见表 1).称取10 g新鲜土样，加入到200 mL的三角瓶中，加入100 mL灭菌的0.85%生理盐水，放到恒温摇床上，28 ℃振荡24 h.取出后静置15 min左右，在超净工作台上用灭菌的生理盐水稀释至10^-3.Biolog Eco平板在恒温培养箱预热到25 ℃后取出，用微量移液器取150 μL稀释后的菌液于Biololg生态板各孔中，然后放入恒温培养箱中，28 ℃恒温培养12 d，分别在24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288 h时用Thermo Scientific Multiskan Spectrum全波长酶标仪读取各孔在590 nm波长下的吸光值.采用培养98 h的吸光值计算土壤微生物群落多样性指数.选择Shannon多样性指数(H)、Shannon均匀度指数(E)、Simpson指数(1-G)，分别评价土壤微生物丰富度、均匀度及某些菌种的优势度，各指数的计算公式可参考文献(王强等，2010).

表 1(Table 1)

表 1 ECO板碳源 Table 1 Carbon sources in ECO

表 1 ECO板碳源 Table 1 Carbon sources in ECO 编号 碳源种类 A1 A2 A3 A4 B1 B-甲基-D-葡萄糖苷 衣康酸 L-苯基丙氨酸 i-赤藓糖醇 B2 D-半乳糖酸内脂 甘氨酰-L-谷氨酸 吐温80 2-羟基苯甲酸 B3 L-精氨酸 D-纤维二糖 D-甘露醇 D-葡萄糖胺酸 B4 丙酮酸甲酯 α-D-葡萄糖-1-磷酸 4-羟基苯甲酸 D-苹果酸 B5 D-木糖 α-丁酮酸 L-丝氨酸 腐胺 B6 D-半乳糖醛酸 苯乙胺 α-环式糊精 L-苏氨酸 B7 L-天门冬酰胺 α-D-乳糖 N-乙酰-D-葡萄糖胺 肝糖 B8 吐温40 D，L-α-磷酸甘油 γ-羟丁酸

数据用SPSS13.0、DPS9.50和Excel软件进行统计分析，多重比较采用Tukey法，所有测定数据以平均值±标准误表示.

通过对植株生长指标的测定，评价铀对美洲商陆生长的影响，实验结果见表 2.由表 2可知，铀胁迫后美洲商陆各部分干重变化明显，均表现为在低剂量铀胁迫下增加，在高剂量铀胁迫下降低的趋势.低剂量(25 mg · kg^-1)铀处理下，植物叶干重显著高于对照17.49%(p＜0.05)，而根和茎干重则略微上升；在中剂量(50 mg · kg^-1)铀处理下，根、茎和叶的干重与对照相比没有显著性差异；当铀处理剂量为100 mg · kg^-1时，根、茎和叶的干重均显著低于对照20.09%、47.86%、27.32%(p＜0.05).这表明随着土壤铀剂量的增加，美洲商陆根、茎、叶的干重均呈现先增大后减小的变化趋势.碳水化合物是植物干重的主要成分，因此，低剂量(25 mg · kg^-1)铀能增加美洲商陆叶片中碳水化合物含量，高剂量(100 mg · kg^-1)铀处理则减少美洲商陆各部分中碳水化合物的含量.

表 2(Table 2)

表 2 不同剂量铀胁迫对美洲商陆生长的影响 Table 2 The influence of different uranium concentration stress on pokeweed growth

表 2 不同剂量铀胁迫对美洲商陆生长的影响 Table 2 The influence of different uranium concentration stress on pokeweed growth 处理 生物量/(g·株-1) 植株尺寸/cm 根 茎 叶 株高 茎粗 叶长 叶宽 注：表中数据为平均值±标准误(n=3)，同一列不同字母表示差异显著(p＜0.05). CK 4.28±0.10a 2.57±0.22a 3.66±0.15b 35.22±1.75b 0.210±0.012a 10.73±0.59a 7.90±0.06a U25 4.75±0.18a 2.85±0.11a 4.30±0.19a 42.07±0.87a 0.210±0.009a 11.33±0.34a 8.13±0.19a U50 4.32±0.19a 2.61±0.22a 3.90±0.08b 31.98±0.95b 0.190±0.003ab 9.92±0.04a 7.63±0.03a U100 3.42±0.12b 1.34±0.10b 2.66±0.09c 19.10±0.90c 0.160±0.009b 7.72±0.10b 5.30±0.36b

由表 2可知，随着铀处理剂量的增加，美洲商陆株高、茎粗、叶长和叶宽均呈先上升后下降的变化趋势.在低剂量(25 mg · kg^-1)铀处理下，植物株高显著高于对照19.45%(p＜0.05)，而茎粗、叶长和叶宽则略微增加.中剂量(50 mg · kg^-1)铀处理时，植物的株高、茎粗、叶长及叶宽与对照相比都略微降低.但当高剂量(100 mg · kg^-1)铀处理土壤时，植物的株高、茎粗、叶长及叶宽均显著低于对照45.77%、23.81%、28.05%、32.91%(p＜0.05).

以上结果表明，低剂量(25 mg · kg^-1)铀胁迫能促进美洲商陆生长，增加叶的干重和株高，中剂量(50 mg · kg^-1)铀胁迫对美洲商陆的生长影响不显著，高剂量(100 mg · kg^-1)铀胁迫则显著抑制美洲商陆生长，株高、茎粗、叶宽和叶长都显著降低.

不同剂量铀处理时美洲商陆根、茎和叶中的铀富集量见图 1.从图 1可以看出，在铀污染土壤中生长的美洲商陆，其不同部位铀富集量均高于对照.随着土壤中铀含量的增加，美洲商陆根中铀富集量从低剂量(25 mg · kg^-1)下为对照的20.5倍一直上升，最高剂量(100 mg · kg^-1)下铀富集量为对照的51.85倍；茎中铀富集量随着铀处理剂量的增加而增加，为对照的7.4~49.4倍；而叶中铀的富集量则表现出先上升后下降的变化规律，在U50处理时叶中铀的富集量达到最大值45.33 μg，为对照的7.94倍.当土壤中铀含量由50 mg · kg^-1增大到100 mg · kg^-1时，茎中铀富集量显著升高6.25 μg，叶中铀富集量显著下降6.12 μg，而根中铀富集量变化不显著.由此推断，土壤铀含量达到一定值时，根中铀的富集量达到最大值，叶中的铀向茎中转移，此结果验证了美洲商陆对铀胁迫有较强耐性(吴彦琼等，2010).从根、茎、叶对铀的富集情况来看，不同剂量铀处理下植株各部分铀的分布规律均相同，富集铀规律是：根＞叶＞茎，铀主要富集在美洲商陆的根中.

图 1(Fig. 1)

图 1 不同剂量铀胁迫对美洲商陆根、茎、叶铀富集量的影响(图中数据为平均值±标准差(n=3)；不同字母表示差异极显著(p＜0.01)) Fig. 1 The influence of different uranium concentration stress on the average uranium enrichment in root，stem and leaf of pokeweed

Biolog-Eco板中每孔的平均吸光值(Average Well Color Development，AWCD)是表征土壤微生物群落活性的重要指标.从图 2可以看出，CK、U25和U50处理在培养24 h内对底物的利用率不明显；U100处理在培养48 h内对底物的利用率不明显.由此可见，100 mg · kg^-1铀处理下，美洲商陆根际微生物对Biolog-Eco板中碳源利用比对照和其它2个处理更迟缓.在培养48~144 h内，对照和处理组之间均存在显著性差异(p＜0.01)，利用碳源能力的大小顺序为：CK＞U25＞U50＞U100，这与土壤中铀含量的顺序相反.而在培养168、192、216、240、264和288 h时，对照根际微生物代谢强度显著高于各处理组(p＜0.01)；U25根际微生物代谢强度显著高于U50和U100(p＜0.01)，而U50和U100根际微生物对碳源利用能力水平相当.此结果表明，随着土壤铀含量的增加，美洲商陆根际微生物对碳源利用能力逐渐减弱.

图 2(Fig. 2)

图 2 不同剂量铀胁迫下美洲商陆根际微生物群落在Biolog-Eco中的平均颜色变化率 Fig. 2 The average well color development(AWCD)of pokeweed rhizosphere microbial under different uranium concentration in Biolog-Eco

根据培养96 h的AWCD值评价微生物群落对6类碳源的利用程度(图 3)，结果表明，对糖类利用率顺序是CK＞U25＞U50＞U100，且各处理之间存在极显著差异(p＜0.01)；对氨基酸类利用率顺序为CK＞U25＞U100＞U50，除CK与U25之间没有显著差异外(p＞0.05)，其他处理之间均存在极显著差异(p＜0.01)；对羧酸类利用率顺序是CK＞U100＞U50＞U25，且存在极显著差异(p＜0.01)；对多聚物利用率顺序为U25＞U100＞CK＞U50，且各处理间存在极显著差异(p＜0.01)；对胺类利用率顺序是CK＞U25＞U50＞U100，CK处理显著高于其他3个处理(p＜0.01)；对酚酸类的利用率顺序为U25＞U50＞U100＞CK，各处理间存在显著差异(p＜0.05).Pearson相关分析结果见表 3，从表 3可知，不同剂量铀处理下，美洲商陆根际微生物对糖类利用能力与土壤中铀含量呈显著负相关(r=-0.984，p＜0.05)，但对其他碳源的利用能力与土壤中铀含量却无显著性关系.

图 3(Fig. 3)

图 3 不同剂量铀胁迫下美洲商陆根际微生物对6类碳源利用的吸光值(不同小写字母表示差异极显著(p＜0.01)，不同大写字母表示差异显著(p＜0.05)) Fig. 3 The AWCD of six kinds of carbon sources utilized by pokeweed rhizosphere microbial under different uranium concentration stress

表 3(Table 3)

表 3 不同铀剂量与6类碳源Person相关性分析 Table 3 The person correlation analysis between uranium concentration and six kinds of carbon sources

表 3 不同铀剂量与6类碳源Person相关性分析 Table 3 The person correlation analysis between uranium concentration and six kinds of carbon sources 糖类 氨基酸 羧酸类 多聚物 胺类 酚酸类 注：括号中数据为p值，* p＜0.05(双尾检验). 铀剂量 -0.948(0.016)* -0.805(0.195) 0.167(0.833) -0.011(0.989) -0.867(0.133) -0.291(0.709)

以96 h的AWCD计算对照和处理组微生物群落的多样性指数.本文采用Shannon指数(H)、Shannon均匀度(E)、Simpson指数(1-G)分别表征美洲商陆根际土壤微生物群落的丰富度、均匀度及某些最常见种群的优势度.从表 4可以看出，3个指数均发生了极显著变化(p＜0.01).随着土壤中铀含量的增加，Shannon多样性指数和均匀度指数明显减小，Simpson指数明显增大.由此得出，美洲商陆在铀胁迫下，根际微生物群落的多样性、均匀度及优势微生物种类均降低.

表 4(Table 4)

表 4 不同剂量铀胁迫下美洲商陆根际微生物功能多样性指数 Table 4 The functional diversity indexes of pokeweed rhizosphere microbial under different uranium concentration stress

表 4 不同剂量铀胁迫下美洲商陆根际微生物功能多样性指数 Table 4 The functional diversity indexes of pokeweed rhizosphere microbial under different uranium concentration stress 处理 多样性指数H 均匀度指数E Simpson指数1-G 注：表中不同字母表示差异极显著(p＜0.01). CK 2.96a 23.07a 0.06d U25 2.69b 18.09b 0.08c U50 2.56c 17.12c 0.10b U100 2.08d 7.00d 0.17a

对96 h 6类碳源的AWCD值进行聚类分析和主成分分析(图 4)，可以清晰直观地显示各研究对象之间的远近关系.聚类分析(图 4a)表明，对照是单独一类，U25、U50和U100是一类，其中，U50和U100之间距离最短，表明铀含量越高，美洲商陆根际微生物群落相似性越大.为了探讨不同程度铀胁迫下根际微生物群落的变化情况，对96 h数据标准化后，进行主成分分析.两个主因子的主成分分析(图 4b)中，第1主成份(PC1)解释了58.17%的数据变异，第2主成份(PC2)为26.52%.在二元平面图PC1上对照(CK)分布在正轴上，低、中、高剂量铀处理(U25、U50、U100)主要分布在负轴上；PC2上对照(CK)和低剂量铀处理(U25)主要分布在正轴上，中和高剂量铀处理(U50、U100)主要分布在负轴上，U50和U100聚集在一起.表 5列出了与第一主成分和第二主成分分别具有较高相关系数的各种碳源及主成分载荷量.对主成分1具有分异作用的主要碳源是糖类和羧酸类，对主成分2具有分异作用的主要碳源是糖类和氨基酸.

图 4(Fig. 4)

图 4 不同剂量铀胁迫下美洲商陆根际微生物代谢特征聚类分析和主成分分析(培养96 h) Fig. 4 Cluster analysis and principle components analysis on pokeweed rhizosphere microbial community under different uranium concentration stress(incubation for 96 h)

铀元素物理化学性质比较特殊，目前尚未发现以铀作为必需营养元素的植物，但许多植物诸如向日葵、印度芥菜等会将大量铀吸附于其根部，有的植物还会将其转运到地上部分，这些都为植物修复技术治理土壤中的铀污染提供了可能(Oh et al., 2014).美洲商陆是大生物量优势草本植物，在多种矿区均有分布，适应性很强，对锰、镉有很好的富集效果(吴彦琼等，2010; 王瑞兰等，2004; 聂发辉，2006).本研究发现低剂量铀能促进美洲商陆的生长，中、高剂量铀则会抑制美洲商陆生长.由此推断，铀污染对美洲商陆生长的影响存在一个阈值，该阈值可能介于25~50 mg · kg^-1之间，这对于评价土壤质量对生态系统的稳定性具有重要意义.对美洲商陆根、茎、叶中铀含量的测定发现，美洲商陆能把土壤中的铀吸附并大量地储存于根部，这表明美洲商陆耐铀性强，能从土壤中富集铀，具有修复铀尾矿的潜质.

平均吸光度(AWCD)可以表征微生物对碳源的利用率，是微生物群落利用单一碳源能力的一个重要指标(Fang et al., 2009)，最终的AWCD值与微生物群落中能利用单一碳源的微生物种类和数量有关.AWCD值越大，表明群落总体活性越高；反之，活性越低(谢文军等，2008).本研究中，根际土壤微生物代谢活性随培养时间的延长而增强，但高剂量(100 mg · kg^-1)铀胁迫下根际微生物代谢较为迟缓，培养48 h后才表现出代谢活性，说明高剂量铀胁迫严重抑制了根际微生物的活性，这与大部分研究结果相符(Wenderoth et al., 2001; Wenderoth et al., 1999;王秀丽等，2003).研究表明(沈德中，2002)，一般在低剂量下，重金属对微生物有刺激作用，能使微生物代谢活性增强；在高剂量下，重金属对微生物代谢活性有抑制作用.而本研究中，各剂量铀都表现出对美洲商陆根际微生物代谢活性的抑制作用，最可能原因是由于美洲商陆对铀的耐性强，根际土壤铀含量太大，铀毒害作用可以引起细胞死亡，抑制根际微生物活性，从而降低了根际微生物种类和数量，导致根际微生物活性的降低(Shen et al., 2008).尽管随着铀胁迫导致美洲商陆根际微生物种类和数量降低，代谢活性减弱，但美洲商陆铀含量却显著增加，这说明铀胁迫导致的根际微生物种类和数量减少，代谢活性减弱，对美洲商陆富集铀的能力影响不大.从根际微生物对6类碳源的利用结果看，铀胁迫使根际微生物对糖类、羧酸类和胺类的利用都显著降低，而对酚酸类的利用却显 著升高，因此，酚酸类碳源可能是美洲商陆根际铀污染中单一敏感的一类碳源.此外，本研究中随着铀剂量的增加，美洲商陆提取铀量不断增加，这表明，尽管铀含量的增加导致美洲商陆根际微生物活性降低，但微生物类群对根际土壤铀的活化能力却增强，才导致植物对铀的提取量增加.

表 5(Table 5)

表 5 与PC1和PC2显著相关的主要碳源 Table 5 Main substrates with high correlation coefficients to PC1 and PC2

表 5 与PC1和PC2显著相关的主要碳源 Table 5 Main substrates with high correlation coefficients to PC1 and PC2 主成分 碳源 r PC1 糖类 D-半乳糖酸内脂 0.980 甘氨酰-L-谷氨酸 0.965 L-精氨酸 0.979 L-天门冬酰胺 0.978 吐温 40 0.964 羧酸 苯乙胺 0.964 α-D-乳糖 0.954 D，L-α-磷酸甘油 0.980 多聚物 2-羟基苯甲酸 0.971 D-苹果酸 0.933 胺类 N-乙酰-D-葡萄糖胺 0.981 γ-羟丁酸 0.974 氨基酸 α-环式糊精 0.996 PC2 糖类 衣康酸 0.979 D-木糖 0.969 多聚物 腐胺 0.971 氨基酸 L-苯基丙氨酸 0.981 4-羟基苯甲酸 0.946

土壤铀污染不但对根际土壤微生物代谢活性产生影响，而且改变了根际微生物群落功能多样性，使微生物对碳源的选择发生转移.康敏明等(2009)在广州工业区的研究表明，重金属胁迫导致土壤微生物代谢活性滞后，微生物群落功能多样性降低.本研究中铀胁迫得到类似结果：随铀胁迫程度的增加，Shannon多样性指数和Shannon均匀度指数明显减小，Simpson指数明显增大，说明铀胁迫降低了根际微生物群落功能多样性、均匀度及优势微生物种类.根际微生物对各类碳源利用情况表明，对糖类、羧酸类和胺类的利用显著降低，对酚酸类的利用显著升高.应用96 h各类碳源的吸光值进行聚类分析和主成分分析，结果显示(图 4)，不同剂量铀胁迫均使美洲商陆根际微生物对碳源的利用模式异于对照组，这可能是因为铀毒引起根际土壤养分发生改变，导致铀敏感微生物的死亡，耐铀微生物数量增加，从而改变了微生物类群.由于美洲商陆对铀的富集量显著增加，由此推断，根际耐铀微生物可能会调节土壤中铀的生物有效性，协助美洲商陆吸收铀和抵抗铀胁迫.Garl and 等(1991)研究认为，各样本在空间上位置的不同是与碳底物的利用能力相关联的.具体而言，PC轴坐标的差异是与聚集在该PC轴上碳源相联系的.对照和铀处理根际微生物群落对碳源利用的差异主要体现在PC1上，对照和处各理分别分布于PC1的正轴和负轴，因此，对照根际微生物对PC1所代表的糖类和羧酸类等碳源具有较高的利用；而铀胁迫下根际微生物对PC1所代表的碳源利用较低，这表明铀胁迫下美洲商陆根际微生物群落发生的改变，可能是由于利用糖类和羧酸类碳源的微生物数量减少所致.这与Gremion等(2004)的研究结果相似，微生物对重金属的适应可能是以减少以某种特殊有机物为碳源的微生物数量为代价的.

1)低剂量铀污染可以促进美洲商陆生长，表明高剂量铀污染抑制了美洲商陆生长，铀污染对美洲商陆生长的影响可能存在一个阈值，该阈值介于25~50 mg · kg^-1之间，具体值还有待研究.铀在美洲商陆各部位的分布情况为根＞叶＞茎，美洲商陆对铀的总富集量较大，是一种较为理想的修复铀尾矿的多年生草本植物.

2)土壤中铀含量与美洲商陆根际微生物代谢活性呈负相关，铀胁迫导致根际微生物对糖类、羧酸类和胺类的利用显著降低.

3)铀胁迫致使美洲商陆根际微生物群落异于正常情况下的根际微生物群落.一方面铀胁迫降低了根际微生物群落功能多样性、均匀度及优势微生物种类，另一方面铀胁迫导致对碳源的选择发生改变.然而，美洲商陆根际微生物群落中究竟哪些微生物发生改变，所产生的效应如何，还有待进一步深入研究.