沼气发酵是有机物质在厌氧环境中被各种各样的微生物分解产生主要成分为甲烷(CH₄)和二氧化碳(CO₂)等可燃性混合气体的生物化学过程(Frigon and Guiot， 2010;Vivekanand et al., 2012).沼气发酵不仅提供了一种替代能源，而且可以转移有机废物和减少垃圾堆温室气体排放量，产生清洁能源和优质有机肥，是实现物质资源化再利用的重要过程(Frigon and Guiot， 2010；Mata-Alvarez et al., 2000).液态沼气发酵的总固形物含量(TS)一般控制在15％或更少.沼气干发酵的TS含量一般在15%~40％之间(Guendouz et al., 2010).沼气干发酵与液态沼气发酵相比有许多优点，包括需水量低、设备构造简单、运行过程稳定、减少臭气排放、加热和搅拌耗能低以及发酵残渣易处理等(Li et al., 2011a，2011b；祝其丽等，2013).然而沼气干发酵中发酵底物以不流动的固态存在，含水量低，搅拌困难，发酵微生物细胞和反应中间产物在介质中的传递和扩散受到严重限制，局部区域代谢产物容易积累造成酸抑制(陈闯等，2011)，从而影响产气速率与效率，甚至导致发酵失败.因此，优质足量的接种物是沼气干发酵顺利启动的重要保证，加大接种量是防止前期偏酸、缩短干发酵启动时间的关键措施(陈智远和姚建刚，2009).为了达到接种物分布的均匀性，沼气干发酵的接种量需要达到发酵基料的30%~50%(Martin et al., 2003; 朱圣权等，2009)，造成发酵反应池的容积利用率较低.如何提高单位容积的产气能力以及降低生物转化时间是目前沼气干发酵研究的重点(顾禹，2013)，也是解决上述问题的关键(朱圣权等，2009；李文哲等，2012; 郗登宝等，2013).

本文对比了牛粪液态沼气发酵的剩余物和玉米秸秆沼气干发酵沼渣两种接种物的理化特性及甲烷化菌群落结构，研究了接种物种类和接种量对玉米秸秆沼气干发酵过程启动速度及产气量的影响，探讨了不同接种物种类对沼气干发酵基质特性及微生物群落结构变化的影响.

玉米秸秆晒干后粉碎过5 mm筛.接种物1为以牛粪为主要原料，运行良好的液态沼气发酵后的沼渣.接种物2是以上述玉米秸秆粉和接种物1混合进行沼气干发酵后的残渣，发酵条件为初始固形物含量(TS) 20%，发酵温度37 ℃，物料(F)与接种物(I)比3 : 1(F/I=3，基于VS)，发酵过程产气良好.两种接种物的理化特性及甲烷化菌群落结构均有明显的差异，如表 2所示.试验中所用探针名称及探针序列如表 1所示，探针均由上海生物工程有限公司合成.测定氢甲烷菌的DNA探针5′端用FAM标记，乙酸甲烷菌5′端用TAMRA标记.

表1(Table 1)

表1 试验中测定的微生物类群和相应的探针 Table 1 Experiments of microbial groups and the corresponding probe

表1 试验中测定的微生物类群和相应的探针 Table 1 Experiments of microbial groups and the corresponding probe 探针 目标微生物 探针序列(5′- 3′) 参考文献 S-F-Mbac-1174-a-A-22 氢甲烷细菌 TACCGTCGTCCACTCCTTCCTC (Sekiguchi et al., 1999；Montero et al., 2008) S-F-Msae-0825-a-A-23 乙酸甲烷细菌 TCGCACCGTGGCCGACACCTAGC (Raskin et al., 1994a，1994b；Montero et al., 2008)

表2(Table 2)

表2 原料及接种物特性 Table 2 Characteristics of feedstock and inoculums

表2 原料及接种物特性 Table 2 Characteristics of feedstock and inoculums   接种物1 接种物2 秸秆 注：接种物1为液态牛粪沼气发酵沼渣；接种物2为玉米秸秆沼气干发酵沼渣. TS 15.8% 16.5% 91.2% VS 7.74% 11.1% 88.6% C 5.85% 13.23% 43.7% N 0.26% 0.49% 0.8% C/N 22.5 27.0 53.3 pH 8.32 7.93 N 碱度/(mg Ca(CO3)· kg-1) 1840 1015 N 氢甲烷化菌 56% 54% N 乙酸甲烷化菌 44% 61% N

以玉米秸秆为原料，分别与接种物1、接种物2进行混匀，每种接种物的接种量(F/I)(Schievano A et al., 2010；Dhanalakshmi Sridevi V et al., 2012)均选择为1、3、5三个等级，并以自来水和NH₄Cl调节混合物的TS为20%，C/N为25 : 1.将混合均匀的发酵底物置于1.8 L玻璃发酵反应器中，37 ℃条件下进行厌氧发酵，以铝箔气体采样袋(4 L，大连海得科技有限公司)收集产生的气体.实验期间每天测量气体产量及气体成分.

为了测定发酵过程中物料特性及微生物群落结构变化，F/I为1的发酵罐同时进行6个，分别在第5、10、15、20、30、40天取出1罐进行分析.所有试验均重复2次，试验结果为2次试验的平均值.

总固形物含量TS、挥发性固体(VS)、总碳(TC)、总氮(TN)和pH值等根据APHA(2005)标准程序测定.

气体成分分析采用便携式红外沼气分析仪(Biogas Check，英国 Geotech)测定.气体产量采用湿式气体流量计(LML-1，长春汽车滤清器有限责任公司)进行测定，产气量的计算均基于发酵料中的VS.

采用不同的荧光标记的寡核苷酸探针，利用荧光原位杂交技术(FISH)(马磊等，2008)测定乙酸甲烷菌和氢甲烷菌的数量.利用配备CCD数码相机的荧光显微镜(Nikon 80i，日本尼康)进行镜检拍照.对每个样本随机选取20个视野进行拍照，利用Image-Pro Plus软件对图片荧光面积进行统计分析(Montero et al., 2007，2008).以20张图片的平均荧光面积代表样品中甲烷化菌的浓度，并设定接种物1中的氢甲烷化菌和乙酸甲烷化菌的总量为100%，接种物2及其它样品中的甲烷化菌的量以此为基础计算.

利用SPSS软件以及方差分析(ANOVA)方法对数据进行统计分析，置信度为0.05.

两种接种物的TS含量相近，但由于秸秆中含有大量不能被沼气发酵微生物利用木质素，造成秸秆沼气干发酵残余物沼渣(接种物2)中的VS含量明显高于液体牛粪沼气发酵沼渣(接种物1)中的VS含量.同时，由于接种物1来源于以牛粪为原料的液体沼气发酵罐，牛粪中含有的氨氮使得沼渣具有较高的pH和碱度.由表 2也可以看出，接种物2中的甲烷化菌浓度比接种物1高15%，而且两种接种物的甲烷化菌群结构也有一定的差异.接种物1中氢甲烷化细菌浓度略占优势，而接种物2中乙酸甲烷化菌浓度略高.

不同接种物种类及接种量对沼气干发酵产气 量的影响如图 1所示.以液态牛粪沼气发酵的剩余物为接种物时(接种物1)，随着F/I比的增加，日产气量高峰略有延迟，而且峰值明显降低(图 1a).F/I比为1、3和5的发酵罐的日产气量分别在第3~7天达到了高峰(图 1a).F/I为1的发酵罐的日产气量从第10天开始迅速降低，而F/I比为3和5的发酵罐日产气量峰持续时间较长，三者在40 d内的累积产气总量(图 1e)分别为93.0、98.8、95.5 L · kg^-1，无明显差异(p>0.05).郗登宝等(2013)以液态沼气发酵所得沼渣为接种物，研究了不同接种量对玉米秸秆沼气干发酵产气情况的影响，结果表明3种接种量条件下的产气量差异不大，与本研究的结果基本一致.这可能是因为液态沼气发酵的沼渣中含有丰富的甲烷化菌群，且活性较强，所以接种量(F/I=1~5)对沼气干发酵过程无显著性影响.以上结果说明，以沼液为接种物进行秸秆沼气干发酵时，接种量(基于VS)在20%~50%范围内(基于VS，F/I=1~5)，接种量越高发酵过程启动越快，但对产气总量无影响.

图 1(Fig. 1)

图 1 接种物种类及接种量对产气的影响 Fig. 1 Effects of inoculum type and inoculum size on biogas yield of SS-AD

以玉米秸秆沼气干发酵的沼渣做接种物时(接种物2)，3个不同F/I比的发酵罐在前7 d均有一定程度的产气，但与接种物1的发酵罐相比其日产气量及甲烷浓度均明显较低(图 1a、b、c、d).F/I为1的发酵罐的产气量从第11天开始有所上升，直至第30天才达到产气的高峰，且40 d内的累积产气量为68.8 L · kg^-1(图 1e)，比接种物1的发酵罐低26.0%，但与魏世清等(2011)的结果(60 L · kg^-1)差异不大.F/I比为3的发酵罐的产气量从第23天起略有升高，而F/I为5的发酵罐的产气量在整个发酵过程中始终保持在较低水平，总的产气量分别只有F/I为1的发酵罐的35%和25%.以上结果说明，以干发酵残渣为接种物进行秸秆沼气干发酵时，接种量在50%以上(基于VS，F/I≤1)时发酵过程能顺利启动，当接种量低于25%(F/I >3)时，则会导致发酵失败.

同样接种量条件下，不同种类的接种物对沼气干发酵基质特性产生了显著性的影响.接种接种物1的发酵罐中，F/I为1和3的pH在整个发酵过程中始终保持在较高的水平.F/I为5的发酵罐由于接种量较低，pH在发酵初期的酸化阶段略有降低，但随着产气量上升，产生的酸逐渐被消耗，pH值很快又上升到8.0以上的稳定状态(图 2a).而接种接种物2时，F/I为3的发酵罐中pH在发酵前15 d迅速降低至5.7，F/I为5的发酵罐中pH值在第10天时已降至5.1.这一方面可能是因为沼气干发酵的沼渣(接种物2)作为接种物时，种子难以分布均匀，造成发酵料局部甲烷化微生物菌群缺乏，从而导致酸积累；另一方面可能是因为接种物2的碱度较低(表 2)，当F/I为3或5时(接种量较低)，发酵基质对中间产物酸的缓冲能力较弱.甲烷化菌的生长繁殖和代谢对pH 值非常敏感(Charles et al., 2008; Ward et al., 2008; Wang et al., 2009)，其适宜的生长代谢pH值范围在pH 6.8~7.2，低于6.5则很难生长.因此，酸积累引起了pH值迅速下降，从而抑制了甲烷化菌的生长，应该是导致接种量较低时(F/I=3和5)发酵失败的主要原因(图 2b).

图 2(Fig. 2)

图 2 不同接种物条件下沼气干发酵过程pH值变化 Fig. 2 Variations of pH in the reactors with different inoculums during SS-AD process

由图 3可以看出，两种接种物发酵过程中的微生物整体变化趋势均是先上升后下降且氢甲烷菌的数量均大于乙酸甲烷菌.接种物1的样品中，菌群数量在前期上升较快，后期逐渐下降，甲烷浓度(图 1c)和日产气量(图 1a)均比接种物2的好.接种物2中初始的甲烷化菌浓度较高，但发酵过程中繁殖速度慢，不能及时将产生的有机酸转化成甲烷，造成了一定的酸积累，导致在发酵pH变化较为明显，变化范围从7.7~6.7，而过度的酸积累又进一步抑制了甲烷化菌的生长繁殖和代谢，表明系统的碱度对挥发性酸的积累缓冲能力较差，造成甲烷化菌浓度增长较慢(潘云霞和李文哲，2004)导致前期甲烷浓度(图 1d)和日产气量(图 1b)均比接种物1的差.

图 3(Fig. 3)

图 3 不同接种物发酵过程中的菌群变化(F/I=1) Fig. 3 Different inoculum flora changes during the fermentation

上述结果表明，以液态牛粪沼气发酵的沼渣为接种物时，沼气干发酵过程的启动速度及累积产气量均明显优于以玉米秸秆沼气干发酵沼渣为接种物的发酵罐.以液态牛粪沼气发酵的沼渣为接种物进行秸秆沼气干发酵时，接种量在20%~50%范围内，接种量越高发酵过程启动越快，发酵过程很好，但产气总量无明显差异(p>0.05).以玉米秸秆干发酵残渣为接种物进行沼气干发酵时，接种量在50%以上时发酵过程能顺利启动，且发酵过程良好，但当接种量低于25%时，则会造成中间产物有机酸的积累，从而导致酸抑制和容易造成发酵失败.