金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类广泛存在于生物界、低分子量(6000~7000 Da)、富含半胱氨酸而无芳香族氨基酸和组氨酸、热稳定性良好、可被金属诱导、功能独特的非酶类蛋白质(Hamer，1986；Kagi et al., 1988).自从1957年哈佛大学的Margoshes和Vallee在研究马肾脏蓄积镉的过程中首次发现并分离出MT以来(Margoshes and Vallee， 1957)，在真核微生物、高等植物、原核生物中陆续发现有MT的存在(Carpenè et al.， 2007).研究表明，MT主要与重金属的解毒有关，重金属进入机体可特异性诱导MT的高水平表达，进而螯合一定的重金属形成重金属-MT复合物，或者夺取与其他功能蛋白结合的重金属离子来降低功能蛋白的损伤，减少重金属对组织的损害(Bremner，1987)，这是生物体重要的解毒机制之一.由于水生生物体内的MT与水环境和体内组织中的重金属具有显著的相关性，因此，MT可作为水环境重金属暴露和毒性效应早期警报的主要生物标志物，为水环境污染程度提供客观和全面的指标(Amiard et al., 2006).目前，关于MT作为生物标志物的相关报道主要集中在鱼类、贻贝和牡蛎等软体动物中(Ma et al., 2008)，而蟹类中、特别是与淡水蟹类相关的研究国内外鲜见报道.同时，由于定量检测方法的限制，MT作为生物标志物在环境监测方面的应用还未能进一步开发.目前，MT含量的测定方法主要有金属结合法、电化学法、色谱分析法等，因MT蛋白的特殊性，上述测定方法无一不受MT结合金属种类、MT同形体多态性等因素的影响而对结果产生偏差.而酶联免疫吸附测定(ELISA)以其灵敏性高、特异性好、操作简单、费用低廉且可准确、特异、高通量地实现MT的定量测定，正逐步应用于环境监测、医疗检验等方面(Nakajima et al., 2010; Yudkovski et al., 2008; Apostolova et al., 1998).而建立ELISA方法的关键是高效价、高特异性抗体的制备.

河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)由海洋蟹多元转化而成，属于甲壳纲、十足目中一个特殊分支.作为生活于水体基底层的低等生物，溪蟹直接面对沉积在水体的金属离子，是一种较为理想的水环境监测指示生物，其组织中的MT含量作为一种监测水体重金属暴露的生物标志物，客观反应水体污染水平(Ma et al., 2008).因此，本研究在制备功能性重组河南华溪蟹MT的基础上，利用纯化的融合蛋白SUMO-MT免疫小鼠，获得抗华溪蟹MT抗血清，以期为深入研究MT的重金属解毒机制及进一步建立快速、敏感的ELISA 检测方法奠定基础.

重组工程菌PET-28a-SUMO-MT/BL21(DE3)由本实验室构建、保存，健康雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，羟自由基测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，PVDF 膜(0.22 μm)购自Bio-Rad公司，Quick Antibody-Mouse5W免疫佐剂购自北京康碧泉生物技术公司，HRP标记的羊抗鼠IgG购自GeneTex公司，AP标记的羊抗鼠IgG购自生工生物工程(上海)股份有限公司，邻苯二胺(OPD)和NBT/BCIP 显色剂购自Amresco公司，DAB染色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，其余常规试剂均为国产分析纯.

根据本实验室之前建立的方法，IPTG诱导重组工程菌PET-28a-SUMO-MT/ BL21(DE3)表达河南华溪蟹MT蛋白，经Ni 离子螯合柱分离纯化，制备重组华溪蟹MT(He et al., 2014).纯化获得的重组融合蛋白SUMO-MT经超滤浓缩交换至储存液(0.01 mol · L^-1 Tris-HCl，0.2 mmol · L^-1 PMSF，10 mmol · L^-1 DTT，pH=7.8)后，SDS-PAGE分析其纯度.采用UNICO UV-2102 PC型紫外可见分光光度计在190~300 nm波长下进行紫外光谱扫描分析鉴定重组MT.

根据Yang等(2007)建立的方法略加改良测定重组SUMO-MT的金属结合能力.利用BCA蛋白浓度测定试剂盒，以牛血清白蛋白BSA为标准，测定重组MT蛋白浓度；同时取1 mL重组蛋白纯化样品置于硝化瓶中，加入硝酸/高氯酸(1 ∶ 3)后置于电热板上消化完全，火焰原子吸收分光光度计(日本SH IMDZU AA26300)测定重组蛋白中的Zn含量.重组蛋白SUMO-MT分子量以26000 Da计，SUMO-MT分子与Zn原子的物质的量比R_MT/Zn利用以下公式计算：

式中，R_MT/Zn为SUMO-MT分子与Zn原子的物质的量比，C_MT为重组SUMO-MT蛋白浓度(mg · mL^-1)，C_Zn为重组蛋白中Zn浓度(mg · mL^-1).

羟基自由基(· OH)是体内最活泼的活性氧，而Fenton反应是最常见的产生羟基自由基的化学反应，H₂O₂的量和Fenton反应产生的· OH量成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与· OH的量呈正比(Lindsey et al., 2000).分别在反应体系中加入不同浓度的重组SUMO-MT，检测其清除羟自由基能力.实验方法按照羟自由基测定试剂盒操作说明，在550 nm波长下，用双蒸水调零，测定各管吸光度.羟自由基清除率SR_MT按照以下公式计算：

式中，SR_MT为羟自由基清除率，A_control为空白对照的吸光度值，A_sample为样品的吸光度值.

按照Quick Antibody-Mouse5W免疫佐剂说明书进行小鼠免疫.选择6~8周龄雌性BALB/c小鼠5只，取纯化后的重组SUMO-MT蛋白免疫小鼠.首次免疫每只小鼠取0.5 mL目的蛋白(50 μg · mL^-1)与等体积Quick Antibody-Mouse5W水溶性免疫佐剂迅速混合后，于小鼠后腿小腿肌肉注射免疫，每只小鼠注射100 μL，免疫前尾部静脉取血作为阴性对照.3周后按照同样的方式加强免疫一针.5周后，小鼠摘除眼球取血，室温静置1 h后3000 r · min^-1离心5 min.上清置于4 ℃冰箱内过夜，待血液凝固后，4 ℃、4000 r · min^-1下离心10 min.取上清，加入0.02% NaN₃，无菌分装于-80 ℃保存.

根据Kim等(2011)建立的间接ELISA法测定SUMO-MT抗血清的效价.选取96孔酶标板，每孔用碳酸盐缓冲液(0.5 mol · L^-1 Na₂CO₃/NaHCO₃，pH=9.6)包被重组SUMO-MT(10 μg · mL^-1，100 μL · 孔^-1)，留空白对照孔，4 ℃保存过夜；次日取出，弃去孔内液体，洗涤液PBST(0.01 mol · L^-1 PBS，0.1% Tween，pH=7.4)洗3次，每次5 min；加入BSA封闭液(10 g · L^-1)100 μL · 孔^-1，37 ℃封闭2 h；洗涤3次后，加入pH =7.4、0.01 mol · L^-1 PBS倍比稀释的免疫后小鼠血清及免疫前血清(稀释倍数为200~204800)，100 μL · 孔^-1，37 ℃作用1 h；洗涤3次，加入1 ∶ 5000 PBSTB(0.01 mol · L^-1 PBS，1% BSA，0.1% Tween，pH=7.4)稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃反应1 h;洗涤3次，加入底物邻苯二胺(OPD)溶液100 μL · 孔^-1，暗处显色30 min，加入2 mol · L^-1 H₂SO₄，30 μL · 孔^-1，终止反应.492 nm处酶标仪测定.每块酶标板同时设空白对照、阴性对照和阳性对照.以P/N≥2.1的最高血清稀释倍数表示抗体效价.

重组SUMO-MT蛋白纯化样和重组TF(阴性对照)经15% SDS-PAGE电泳分析后，用电转仪(Bio-Rad)将SDS-PAGE 胶中的蛋白转至PVDF 膜上，用封闭液(PBST+ 5%脱脂奶粉)封闭过夜，PBST 洗膜4次，10 min · 次^-1，加入1 ∶ 500稀释的自制抗血清作为一抗，4 ℃过夜，PBST 洗膜4次后，加入1 ∶ 5000稀释的AP标记的羊抗鼠 IgG，室温反应2 h，用PBST 洗膜4次后，最后用BCIP/NBT 显色试剂盒避光显色并拍照.

免疫组化实验按照DAB染色试剂盒说明书进行.经不同镉浓度(5.8、11.6 mg · L^-1)处理1 d的河南华溪蟹石蜡包埋鳃组织经脱蜡、水化后用柠檬酸缓冲液高压修复抗原，自然冷却后蒸馏水淋洗，再用PBS漂洗2次，每次3 min；滴加内源性过氧化物酶封闭液，室温10 min，PBS充分淋洗；滴加封闭用正常羊血清工作液，室温10 min，甩干；滴加所制备的抗MT血清50 μL，4℃过夜，过夜后37 ℃复温40 min，然后PBS充分淋洗；滴加生物素标记的羊抗鼠IgG，室温10 min，PBS充分淋洗；滴加HRP标记的链霉素亲和素，室温10 min，PBS充分淋洗；DAB显色时间为1~5 min，显色后复染2 min，盐酸酒精分化，PBS充分淋洗，脱水、透明、封片、镜检.

利用本实验之前建立的方法制备了重组河南华溪蟹MT融合蛋白.纯化获得的重组融合蛋白SUMO-MT经 SDS-PAGE检测(图 1)，其分子量约为26 kD，且纯度较高，可以用于特异性抗血清的制备.重组SUMO-MT经超滤交换至储存液后，在190~300 nm波长下进行紫外光谱扫描(图 2)，结果显示，重组蛋白分别在216 nm和285 nm处出现两个特征吸收峰，分析其216 nm处为Zn-MT特征吸收峰，而285 nm处为SUMO标签的特征吸收峰，与预期结果一致.

图 1(Fig. 1)

图 1 SDS-PAGE分析SUMO-MT纯化样品(1：SUMO-MT纯化样品；M：蛋白质Marker) Fig. 1 SDS-PAGE analysis of the purified SUMO-MT(1：the purified SUMO-MT；M：Marker protein)

图 2(Fig. 2)

图 2 重组MT纯化样紫外扫描光谱分析 Fig. 2 UV absorbance spectrometry analysis of recombinant SUMO-MT

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒，以牛血清白蛋白BSA为标准，测定重组SUMO-MT蛋白浓度C_MT为0.827 mg · mL^-1，重组蛋白经硝化、定容后，测定其Zn含量为0.012 mg · mL^-1，根据公式(1)计算其物质的量比为1 ∶ 6，与天然华溪蟹MT蛋白一致，证明重组SUMO-MT仍具有较强的金属结合能力.

利用羟基自由基测定试剂盒，分别在反应体系中加入不同浓度的重组SUMO-MT，检测其清除羟基自由基能力.结果如图 3所示，当重组SUMO-MT浓度为16 μmol · L^-1时，羟基自由基清除率达51%，当浓度为64 μmol · L^-1时，羟基自由基清除率达95%，证明重组SUMO-MT具有较强的清除自由基的能力(图 3).

图 3(Fig. 3)

图 3 重组SUMO-MT蛋白清除羟基自由基能力测定 Fig. 3 Hydroxyl radical scavenging ability of recombinant SUMO-MT protein

采用间接ELISA法测定SUMO-MT抗血清的效价(表 1)，结果表明，以SUMO-MT免疫小鼠，均可获得较高效价的抗血清.其中，3^#小鼠血清效价最高，当最大稀释度至102400时，其OD₄₉₂为0.47，且P/N≥2.1，抗血清的效价高达1 ∶ 102400.

表 1(Table 1)

表 1 小鼠血清效价检测 Table 1 Results of indirect ELISA to determine antibody activities of anti-SUMO-MT serum

表 1 小鼠血清效价检测 Table 1 Results of indirect ELISA to determine antibody activities of anti-SUMO-MT serum 小鼠编号 P/N 稀释比 1# 2.15 1∶12800 2# 2.31 1∶25600 3# 2.41 1∶102400 4# 2.17 1∶ 12800 5# 2.20 1∶51200

以1 ∶ 500稀释的自制抗血清作为一抗，对重组SUMO-MT纯化样、经IPTG诱导的工程菌组织全蛋白和重组TF(阴性对照)进行Western blot分析，结果显示，自制抗血清可以识别重组SUMO-MT而与重组TF无特异性结合(图 4).

图 4(Fig. 4)

图 4 抗血清的Western blot鉴定(1：SUMO-MT纯化样品；2：经IPTG诱导的重组工程菌PET-28a-SUMO-MT/BL21(DE3)全菌样；3：重组TF蛋白对照) Fig. 4 Western blot of recombined SUMO-MT fusion protein with anti-SUMO-MT serum(1：the purified SUMO-MT；2：induced cell extract by 1 mM IPTG；3：recombinant TF protein)

以制备的SUMO-MT抗血清检测了经不同镉浓度(5.8、11.6 mg · L^-1)处理的河南华溪蟹鳃组织，结果显示，所制备的抗血清可以与组织中的MT特异性结合.免疫组化染色结果表明，组织中的MT主要定位于细胞质中，呈棕褐色，且随着镉处理浓度的增加，MT的表达量也在升高(图 5).

图 5(Fig. 5)

图 5 DAB 染色法检测MT蛋白在镉处理河南华溪蟹鳃组织中的表达(a.阴性对照(PBS替代一抗)；b.正常对照组华溪蟹鳃组织；c.5.8 mg · L-1 CdCl2染毒1 d华溪蟹鳃组织；d.11.6 mg · L-1 CdCl2染毒1 d华溪蟹鳃组织；→表示MT；×600倍) Fig. 5 Light micrographs of gill tissue of S. henanense(a.Negative control；b.Control group；c.Exposure to 5.8 mg · L-1 CdCl2 for 1 d; d.Exposure to 11.06 mg · L-1CdCl2 for 1 d; →st and s for MT；×600)

MT是自然界中广泛存在的一种可诱导的应急蛋白质.研究表明，MT具有重金属解毒、清除自由基及防止细胞癌变等功能(Eckschlager et al., 2009).MT因其独特的功能和作用，已成为一种具有广阔应用前景的医药蛋白资源，也是一种理想的保健品、化妆品的添加剂.目前，已有多种来源的MT获得了重组表达(Jie et al., 2005; Sauge-Merle et al., 2012; 曹晓敏等，2007)，但依然存在表达量较低、易降解、极易形成包涵体等诸多问题.这主要是由于MT分子量较小，半衰期短，在大肠杆菌体内不稳定且易被酶降解；且MT富含半胱氨酸，极易形成无生物活性的包涵体.同时，由于MT在大肠杆菌内极不稳定，脱金属硫蛋白对细胞的毒性及细胞对金属离子的耐受性差等问题，一直难以获得比较高的产率(Mejáre et al., 2001).课题组在前期研究中，利用SUMO融合表达系统实现了河南华溪蟹MT的可溶表达.在此基础上，本研究对重组制备的SUMO-MT进行了金属结合能力和自由基清除能力的测定，进一步证实了重组SUMO-MT具有和天然MT蛋白一致的生物学功能.

由于定量检测方法的限制，MT作为生物标志物在环境监测方面的应用还未能进一步开发.目前，国内外许多学者通过免疫学方法(ELISA或免疫组化)对MT进行定量和定位分析测定，但建立该方法的关键是特异性的抗体的制备.而华溪蟹组织MT蛋白分子量仅有7 kD左右，蛋白免疫原性较弱(Kim et al.，2001)，因此，本研究利用分子量为26 kD的功能性重组华溪蟹SUMO-MT蛋白作为抗原.同时，抗血清制备实验中，利用新型的水溶性佐剂Quick Antibody替代传统的福氏佐剂，该佐剂具有免疫针次少、抗原用量低、抗体产生快、抗体滴度高、不需乳化等诸多特点.结果表明，利用SUMO-MT和Quick Antibody佐剂制备了效价较高、特异性好的华溪蟹MT抗血清.该MT抗血清应用于不同镉染毒处理的河南华溪蟹鳃组织免疫组化实验，可特异性识别组织中的MT.MT抗血清的制备，为进一步建立快速、敏感的ELISA 测定方法及MT重金属解毒机制的深入研究奠定了基础.

1)利用SUMO融合表达系统完成了河南华溪蟹MT的重组制备，经SDS-PAGE及紫外光谱扫描鉴定后，检测其仍具有与金属离子结合和清除自由基的生物学功能.

2)以功能性重组河南华溪蟹MT为抗原，制备了小鼠抗血清.该抗血清效价经间接ELISA法测定最高达1 ∶ 102400，Western blot分析其具有良好的特异性，并可特异性识别河南华溪蟹组织中的MT，可应用于免疫组化定位及定性检测.