铅(Pb)是一种常见的环境污染物，能够通过多种方式进入水体，并在水生生物体内蓄积，造成机体各种组织毒性，影响机体的免疫(Dietert et al., 2004；孙晓英等，2005)、抗氧化等的生理功能，进入食物链后进而可危害人畜的生命安全(陈程等，2010).戴伟等(2009)研究发现，饲料中的Pb²⁺能增加罗非鱼肝胰脏丙二醛(MDA)含量，降低总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽(GSH)水平；成嘉等(2006)研究发现，随着Pb²⁺浓度的增高，鲫鱼血清中乳酸脱氢酶(LDH)和过氧化氢酶(CAT)活性下降.另有资料报道，Ca²⁺可降低机体对Pb²⁺的吸收，抑制酶的活性(Simons，1988).Bruening等(1999)研究发现，膳食Ca²⁺可降低肠道内Pb²⁺的吸收，并降低铅中毒的风险.限制饮食中Ca²⁺的摄入可明显增加肠道内Pb²⁺的吸收，钙缺乏也可增加鸟类体内重金属尤其是铅的毒性及生物富集作用(吴荷花等，2005).当增加老鼠饮食中的Ca²⁺，可降低Pb²⁺的吸收和毒性(Bogden et al., 1995).陈中智(2009)也研究发现，Ca²⁺可以降低Pb²⁺对斑马鱼胚胎的毒性效应.抗氧化防御系统的一个重要特征是其活性成分或含量可因污染的胁迫而发生改变，因而可间接反映环境中污染的存在.而有关Ca²⁺对Pb²⁺胁迫引起机体抗氧化系统变化的影响尚未见报道.因此，本实验以鲫鱼为材料，在低浓度Pb²⁺胁迫的同时添加Ca²⁺处理，检测鲫鱼肌肉、鳃中的Pb²⁺含量，探索Ca²⁺对Pb²⁺胁迫引起鲫鱼肝胰脏抗氧化系统的影响，以期阐明Ca²⁺缓解Pb²⁺胁迫的机制，为重金属污染对水生生物毒性机理研究、发展渔业生产和水体重金属污染防治等提供参考资料.

Pb(NO₃)₂、CaCl₂ · 2H₂O、HNO₃、HClO₄均为分析纯.鲫鱼购于枣庄市水产批发市场，平均体重为(255.92±12.82)g，购回后用3%的食盐水浸泡消毒2 min，在盛有自来水(曝气3 d以上)的玻璃水族箱中驯养5 d后，挑选活泼、表面无损伤的健康鲫鱼，随机分成5组，每组10条，养于室内玻璃水族箱(120 cm×45 cm×70 cm，长×宽×高)中，24 h供氧，每天早晨投喂鱼料(鸿达鱼用膨化配合饲料)1次(以1~2 min吃完为宜).实验期间每天换2/3染毒液以保持浓度稳定.

Pb²⁺和Ca²⁺的浓度设计见表 1.染毒处理35 d后，取鲫鱼背部肌肉、鳃，用蒸馏水清洗，滤纸吸干，称取鱼肉3 g左右、鱼鳃1.5 g左右，剪碎，分别放入250 mL的锥形瓶内，加5 mL硝酸，通风橱内过夜.次日，加入3 mL高氯酸，电热板260 ℃消解至澄清，冷却后超纯水定容，待测.

表 1(Table 1)

表 1 Pb2+和Ca2+的浓度设计 Table 1 Concentrations of Pb2+ and Ca2+ in the experimental treatment

表 1 Pb2+和Ca2+的浓度设计 Table 1 Concentrations of Pb2+ and Ca2+ in the experimental treatment 组别 Pb2+浓度/(mg·L-1) Ca2+浓度/(mmol·L-1) Ⅰ组 0 0 Ⅱ组 0.1 0 Ⅲ组 0.1 2 Ⅳ组 0.1 4 Ⅴ组 0.1 6

取鲫鱼肝胰脏1 g，加入9 mL预冷的生理盐水，用玻璃研钵在冰浴下充分研磨，制成10%的组织匀浆液，5000 r · min^-1离心10 min，将上清液4 ℃保存待测.

鲫鱼肌肉、鳃的消解液采用火焰法原子吸收分光光度法检测Pb²⁺的含量，并换算成以mg · kg^-1为单位的数据.

肝胰脏样品上清液中蛋白质含量采用考马斯亮蓝法；MDA含量、T-AOC水平及CAT活性测定均采用南京建成生物工程研究所试剂盒，测试步骤按试剂盒说明进行.

实验所得数据均采用SPSS15.0软件进行单因素方差分析，结果均采用平均值±标准误差表示.

如图 1a所示，与空白Ⅰ组相比，Ⅱ、Ⅲ组鲫鱼肌肉中的Pb²⁺含量(p＜0.05)增高，Ⅴ组鲫鱼肌肉中的Pb²⁺含量(p＜0.05)降低；与单独染Pb²⁺组Ⅱ相比，Pb²⁺+Ca²⁺处理的Ⅳ、Ⅴ组鲫鱼肌肉中的Pb²⁺含量低于Ⅱ组(p＜0.05)，且鲫鱼肌肉中Pb²⁺含量随着Ca²⁺浓度的增加而呈降低趋势.

图 1(Fig. 1)

图 1 鲫鱼肌肉(a)和鳃(b)中Pb2+的含量变化(a表示与Ⅰ组相比较差异显著(p＜0.05)，b表示与Ⅱ组相比较差异显著(p＜0.05)，下同) Fig. 1 Changes of Pb2+ contents in Crucian muscle(a) and gill(b)

如图 1b所示，与空白Ⅰ组相比，Ⅱ、Ⅲ组鲫鱼鳃中的Pb²⁺含量增高(p＜0.05)；与单独染Pb²⁺组Ⅱ相比，Pb²⁺+Ca²⁺处理的Ⅳ、Ⅴ组鲫鱼鳃中的Pb²⁺含量低于Ⅱ组(p＜0.05).

如图 2a所示，与空白Ⅰ组相比，Ⅱ组鲫鱼肝胰脏中CAT活性降低(p＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组鲫鱼肝胰脏中CAT活性升高(p＜0.05).与单独染Pb²⁺组Ⅱ相比，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组鲫鱼肝胰脏中的CAT活性随着Ca²⁺浓度的增加而呈降低趋势，但均高于单独染Pb²⁺组(p＜0.05).

图 2(Fig. 2)

图 2 肝胰脏中CAT(a)和T-AOC(b)活性变化 Fig. 2 Changes of CAT activity(a) and T-AOC activity(b)in hepatopancreas

如图 2b所示，与空白Ⅰ组相比，Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ组鲫鱼肝胰脏中T-AOC活性降低(p＜0.05).与单独染Pb²⁺组Ⅱ比较，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组鲫鱼肝胰脏中T-AOC活性高于单独染Pb²⁺组(p＜0.05).

如图 3所示，与空白Ⅰ组比较，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组鲫鱼肝胰脏中MDA含量升高(p＜0.05).与单独染Pb²⁺组Ⅱ相比，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组鲫鱼肝胰脏中的MDA含量随着Ca²⁺浓度的增加而呈增高趋势，但均低于单独染Pb²⁺组(p＜0.05).

图 3(Fig. 3)

图 3 肝胰脏中MDA含量变化 Fig. 3 Changes of MDA contents in hepatopancreas

提升饮食中的Ca²⁺水平可以降低鱼对铅的吸收(Varanasi et al., 1978)，并认为Pb²⁺的吸收机制与Ca²⁺相同(Rogers et al., 2004).王劲(2003)研究认为，选择合适的Ca²⁺源摄入，可作为防止Pb²⁺接触和降低Pb²⁺毒性措施的一种补充.本实验参照文献中(张红梅，2009；施蔡雷等，2010)的研究剂量，选用0.1 mg · L^-1 Pb²⁺作慢性胁迫实验，发现单独染Pb²⁺组鲫鱼肌肉、鳃中Pb²⁺含量明显高于空白Ⅰ组，而添加2、4、6 mmol · L^-1 Ca²⁺同时处理组，与单独染Pb²⁺组相比，添加Ca²⁺的Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组的Pb²⁺含量均下降，表明Ca²⁺能降低Pb²⁺的吸收.而在4 mmol · L^-1 Ca²⁺组中，鲫鱼肌肉中的Pb²⁺含量低于空白Ⅰ组，这与王劲等(2002)给大鼠分别灌入柠檬酸钙+铝+铅、醋酸钙+铝+铅、碳酸钙+铝+铅，检测铅和铝的吸收率为负值的结果一致.他的解释是“服用钙剂可能会促进体内原先蓄积的铝、铅大量排出，或可能是因为生长发育期大鼠体内物质更新转换很快，体内铝、铅经肠道粘膜细胞脱落和胆汁迅速排入肠道，从而出现了铝、铅在粪中排出量远远大于摄入量”.这表明4 mmol · L^-1的Ca²⁺可能促进了鲫鱼肌肉内Pb²⁺的动员，其具体作用机制还有待进一步研究.

CAT是机体抗氧化系统的一种酶，可催化分解细胞代谢产生的H₂O₂和其他氧化物，使机体免受自由基攻击，在调节细胞免于死亡的过程中起着重要作用.T-AOC水平则是用于衡量机体抗氧化系统功能的综合性指标，CAT和T-AOC活性对Pb²⁺胁迫非常敏感，其活性变化可反映机体的氧化损伤情况，并被作为环境污染早期预警指标(刘浩明等，2012).MDA是自由基引发的脂质过氧化的终产物，其含量可反映机体内脂质过氧化的程度.本研究发现，单独染Pb²⁺组鲫鱼肝胰脏中CAT和T-AOC活性显著低于空白对照Ⅰ组，而MDA含量显著增高，这与胡蓉等(2011)对鲫鱼肝胰脏中CAT的研究以及成嘉等(2006)对鲫鱼血清中CAT的研究和戴伟等(2009)对罗非鱼肝胰脏中T-AOC、MDA的研究结果一致.说明低浓度Pb²⁺暴露造成了鲫鱼体内脂质过氧化产物增高，清除自由基的能力降低，表明鲫鱼肝胰脏的抗氧化系统受到损伤.添加Ca²⁺同时处理后，与单独染Pb²⁺组相比，添加Ca²⁺的Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组的CAT和T-AOC活性增强，而脂质过氧化产物MDA含量降低，说明Ca²⁺对鲫鱼肝胰脏氧化损伤具有修复作用，但其作用机制还有待进一步研究.本实验结果还发现，添加Ca²⁺的Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组的CAT活性也高于空白对照Ⅰ组，而T-AOC活性低于Ⅰ组，脂质过氧化产物MDA含量也低于Ⅰ组，表明Ca²⁺的存在能大大地诱导鲫鱼肝胰脏CAT活性，这可能是Ca²⁺浓度增加导致了鲫鱼体内代谢过程中CAT的活化，对其具体作用机制还有待进一步研究.

鲫鱼暴露在0.1 mg · L^-1 Pb²⁺中35 d后，鲫鱼体内Pb²⁺含量增加，CAT和T-AOC活性降低，MDA含量增加；同时添加Ca²⁺处理后，Ca²⁺能减少Pb²⁺蓄积，诱导CAT和T-AOC活性，降低MDA含量，表明Ca²⁺能修复Pb²⁺胁迫的毒性效应.