硝化作用是土壤氮素转化的主要途径之一.一般认为低pH值不利于硝化作用的进行(鲍俊丹等，2011; 范晓晖和朱兆良，2002; 佟德利等，2012; 王帘里和孙波，2011)，但长期施用氮肥会提高酸性土壤硝化活性(范晓晖等，2005；贾俊仙等，2010; Zhong et al., 2007)，旱作还会消除酸性土壤(pH 4.22~6.27)硝化作用的延滞期，促进NH⁺₄-N快速转化成NO^-₃-N(赵维和蔡祖聪，2011).菜地土壤施肥(氮)量较高，硝化活性显著高于一般旱地土壤(贺发云等，2005; 施振香等，2009)，土壤pH 4.61的菜地氮素硝化率可达70.4%(胡晓霞等，2009)，多年蔬菜连作造成氨氧化细菌优势种富集，土壤硝化势明显高于短期蔬菜种植土壤(孟德龙等，2012).酸性菜地土硝化活性增强会增加土壤剖面硝酸盐累积，氮素淋洗和反硝化损失风险增加，因此这一过程的作用机理、影响因子以及调控措施亟待进一步研究.

生物炭(biochar)是生物残体在缺氧的情况下经高温热裂解(350~600 ℃)产生的一类难熔的、稳定的、高度芳香化的、富含碳素的固态物质，是近年来推行的固碳减排农田新技术.生物炭吸附固定NH⁺₄(Clough and Condron， 2010; Nieder et al., 2011)和NH₃(Taghizadeh-Toosi et al., 2012a，2012b)，高C/N比刺激微生物对土壤无机氮的固定(Lehmann et al., 2003; Zavalloni et al., 2011)，但也有生物炭对土壤无机氮库没有影响的报道(Jones et al., 2012; Scheer et al., 2011)，因此生物炭是否可以减缓酸性菜地土硝化作用值得探索，另外生物炭一般呈碱性(Spokas et al., 2011; Yuan et al., 2011)，添加生物炭后酸性土壤pH值有不同程度地增加(侯艳伟等，2011; Masulili et al., 2010; Yuan and Xu， 2011)，这是否反而促进土壤硝化作用也有待进一步研究.为此，本试验采集不同生物炭用量盆栽试验土壤进行短期好气培养，结合土壤性质的变化探讨影响这一过程的驱动因子，以期为理解生物炭对酸性菜地土硝化作用的影响以及生物炭的应用前景提供参考.

生物炭原料为水稻秸秆和花生壳，粉碎后分别装入铁盒中盖盖密封，于马弗炉中温度升至400 ℃，保持2 h，断电1 h后开箱30 min，冷却至室温后取出.水稻秸秆炭全氮15.64 g · kg^-1，全磷3.03 g · kg^-1，全钾64.57 g · kg^-1，pH值9.62；花生壳炭全氮24.10 g · kg^-1，全磷3.73 g · kg^-1，全钾42.27 g · kg^-1，pH值8.96.供试土壤采自湖南省长沙县榔梨镇大元村(N28°11.580′，E113°5.406′)，红壤壤土，蔬菜种植历史超过15年，蛇形取样法采集0~20 cm土样，混合均匀后风干，土壤有机质16.18 g · kg^-1，全氮1.67 g · kg^-1，全磷0.65 g · kg^-1，全钾14.55 g · kg^-1，土壤pH值5.19.

水稻秸秆炭和花生壳炭以1 : 1.5(w : w)混合均匀后过1 mm筛，设置5个不同生物炭用量盆栽试验处理：①CK，不施氮肥和生物炭处理为对照；②NB₀：施氮肥、不施生物炭处理；③NB_0.02：施氮肥和2%生物炭(烘干土重)处理；④NB_0.05：施氮肥和5%生物炭(烘干土重)处理；⑤NB_0.1：施氮肥和10%生物炭(烘干土重)处理，3次重复.供试蔬菜作物为蕹菜(Ipomoea aquatica Forsk.)，生长期为60 d.盆栽试验施氮量(以N计)97.5 mg · kg^-1，其中移栽前基施65 mg · kg^-1，其余氮肥平均分两次在移栽后21d和42d追施.全部处理均施用磷肥(以P₂O₅计)(用量65 mg · kg^-1)和钾肥(以K₂O计)(用量130 mg · kg^-1)，磷肥一次性基施，钾肥60%基施，其余40%分两次同氮肥一起追施.氮磷钾肥分别为尿素(46%N)、过磷酸钙(12%P₂O₅)、氯化钾(60% K₂O).采集盆栽试验结束后的土壤进行硝化作用研究.

称取盆栽试验结束后各处理风干土样60 g置于250 mL三角瓶，调节土壤含水量至45%土壤持水量，用透气保水膜封口，于25 ℃黑暗条件下预培养1周以激活微生物.预培养结束后测定土壤铵态氮、硝态氮和土壤pH值，记为0 d.预培养土样加入硫酸铵(以NH⁺₄-N计)(100 mg · kg^-1)同时调节土壤含水量至60%土壤持水量，于25 ℃黑暗条件下培养，在第1、3、5、7、10、14 d测定土壤中的 NH⁺₄-N和NO^-₃-N 含量.

土壤pH值：水土比5 : 1，pH计测定；土壤EC值：水土比5 : 1，电导仪测定；土壤CEC：乙酸钠交换法；土壤NH⁺₄-N：2 mol · L^-1KCl浸提，靛酚蓝比色法测定；土壤NO^-₃-N：去离子水浸提，酚二磺酸比色法测定；微生物量碳、氮：氯仿熏蒸浸提法；土壤氨氧化潜势：称取相当于5.00 g鲜土于 50 mL塑瓶中，加入20 mL(1 mmol · L^-1)磷酸缓冲液(g · L^-1：NaCl，8.0；KCl，0.2；Na₂HPO₄，2.88；KH₂PO₄，0.24；pH7.4)，其中含有1 mmol · L^-1(NH₄)₂SO₄(0.132 g · L^-1)，50 mg · L^-1 NaClO₃(抑制亚硝酸的氧化).放于室温(25 ℃)黑暗处培养24 h，培养结束，加5 mL(2 mol · L^-1)KCl溶液提取NO^-₂，过滤，上清液用流动分析仪(FIAStar 5000 Analyzer)测定NO^-₂.土壤持水量：把过20目筛的风干土样20.00 g置于用棉球塞住的漏斗中，加去离子水浸泡2 h，加盖，除去棉塞，让水分自由下渗，放置过夜后，测定土壤重量含水量作为土壤持水量.脲酶活性：靛酚蓝比色法.氨氧化细菌数量：最大或然法(MPN)

数据采用Excel 2003和SPSS 13.0进行数据整理、方差分析与多重比较.采用拟合模型对土样的NO^-₃-N累积量随时间变化进行拟合，并判断其增长模式和延滞时间(赵维和蔡祖聪，2011)，Logistic 曲线初始值的估计方法参见文献(董江水，2007).

盆栽结束后，各处理土壤理化性质和生物学性质差异显著.土壤pH值、EC值、CEC值、土壤持水量和氨氧化细菌数量随生物炭用量增加显著升高.NH⁺₄-N含量和氨氧化潜势CK处理最低，NB₀处理最高且显著高于3个生物炭处理，3个生物炭处理NH⁺₄-N含量随生物炭用量的增加显著降低，氨氧化潜势则相反.3个生物炭处理间NO^-₃-N含量没有差异，但显著高于CK和NB₀处理.生物炭处理对脲酶活性和微生物生物量碳影响不明显，显著降低微生物生物量氮含量.CK处理没有施用氮肥和生物炭，其NH⁺₄-N、NO^-₃-N和氨氧化潜势均较低(表 1).

表1(Table 1)

表1 盆栽试验结束后不同生物炭处理的土壤性质 Table 1 Soil properties with different biochar treatments at the end of pot experiment

表1 盆栽试验结束后不同生物炭处理的土壤性质 Table 1 Soil properties with different biochar treatments at the end of pot experiment 指标Parameter CK NB0 NB0.02 NB0.05 NB0.1 注：不同处理同一行相同字母表示处理间差异未达到显著水平(p>0.05). Note：Values with the same letter for same row means no significant difference among different treatments(p>0.05). 土壤酸碱度Soil pH 5.07±0.10d 5.00±0.17d 5.46±0.06c 5.92±0.04b 6.36±0.06a 土壤电导率 Soil EC/(cS·cm-1) 0.20±0.01c 0.26±0.01bc 0.32±0.03bc 0.36±0.03b 0.58±0.13a 阳离子交换量CEC/(cmol·kg-1) 17.25±1.19b 19.71±2.03b 19.19±2.31b 23.30±1.99a 25.37±1.33a 土壤持水量WHC 52.74%±3.54%c 52.88%±0.81%c 55.50%±2.62%bc 61.06%±7.72%b 72.19%±2.66%a 铵态氮NH+4-N/(mg·kg-1) 0.29±0.06d 16.21±2.584a 9.95±1.45b 5.42±2.94c 4.12±0.67c 硝态氮NO-3-N/(mg·kg-1) 53.13±17.86b 105.3±62.10b 207.5±91.21a 177.2±120.2a 195.7±15.64a 氨氧化潜势Potential ammonia oxidizing rate/(μg(NO-2-N)·kg-1·h-1) 0.377±0.067c 2.485±0.743a 0.554±0.098bc 0.785±0.194bc 1.153±0.180b 微生物生物量碳Microbial biomass C/(mg·kg-1) 193.7±7.947a 191.5±7.930a 171.6±45.80a 160.0±14.92a 170.5±16.71a 微生物生物量氮Microbial biomass N/(mg·kg-1) 55.23±18.89ab 60.83±29.31a 28.86±13.48abc 22.42±3.737bc 18.06±5.394c 脲酶活性Soil urase activity/(μg·g-1·24h-1) 394.6±79.91b 550.7±37.46a 473.7±121.3ab 498.3±135.1ab 458.0±114.7ab 氨氧化细菌计数Population of ammonia oxidizing bacteria/(107 cfu·g-1(dry soil)) 73.92±15.34b 65.78±7.141b 108.0±14.86ab 105.3±30.19ab 117.6±26.89a

培养过程中，外源添加硫酸铵后，5个处理NH⁺₄-N含量在培养3 d后随时间快速下降，培养7 d时3个施用生物炭的处理NH⁺₄-N含量为0.34~8.14 mg · kg^-1，培养10 d时NH⁺₄-N含量接近0 mg · kg^-1，CK和NB₀处理NH⁺₄-N含量在培养7 d后下降缓慢，在培养结束后分别为17.54和42.70 mg · kg^-1(图 1a).土壤NO^-₃-N含量在培养开始阶段增加缓慢，培养5 d后增加迅速，特别是3个生物炭处理增幅较大，总体来看，5个处理NO^-₃-N含量随时间变化呈“S”型增长特点.根据赵维和蔡祖聪(2011)对土壤NO^-₃-N累积量随时间变化模式判定方法，NO^-₃-N累积量随时间的变化类似“S”型增长曲线(图 1b)，NO^-₃-N的增长没有经历明显的延滞期，增长速率达到最大后减小.采用 Logistic 修正模型 N=N_p/(1+e²·e^-rt)(设定延滞期 t_d=0)对这5个处理NO^-₃-N累积量随时间的变化的进程进行拟合，R²_S变化范围 0.656~0.895(表 1，p<0.05)，均达到显著水平，且大于用“J”型方程拟合的 R_J²值(表 2).由拟合参数计算获得的土壤最大硝化速率(K_max)变化范围为 40.08~97.89 mg · kg^-1 · d^-1，NB_0.05和NB_0.1 K_max最大，分别为97.89和97.55 mg · kg^-1 · d^-1，其次为NB_0.02处理，为84.02 mg · kg^-1 · d^-1，NB₀和CK处理最小，分别为47.07和40.08 mg · kg^-1 · d^-1(表 2).达到最大硝化速率的时间(t₀)变化范围为5~20 d，NB₀处理t₀较长，为20 d，其次是CK处理，为14 d，3个生物炭处理t₀较短，为5~7 d，生物炭处理土壤具有较高的K_max和较短的t₀，在相同培养期时间内(14 d)添加生物炭的处理土壤NO^-₃-N累积量最大.由表 2的Logistic模型可知，5个处理最大硝化潜势(N_p)大小顺序为NB₀(1742 mg · kg^-1)>NB_0.05(1434 mg · kg^-1)> NB_0.1(1292 mg · kg^-1)> NB_0.02(1003 mg · kg^-1)> CK(732 mg · kg^-1)，结合表 1中NB₀处理氨氧化潜势显著高于其余处理，以及CK处理土壤的硝化潜势最低，说明氮肥会激发土壤硝化潜能，配合施用生物炭能降低土壤最大硝化潜势，与NB₀处理相比，3个生物炭处理N_p降低17.7%~42.4%.

图 1(Fig. 1)

图 1 培养期间铵态氮(a)、硝态氮(b)和土壤pH(c)变化 Fig. 1 Diagram of NH+4-N(a)，NO-3-N(b) and soil pH(c)

表2(Table.2)

表2 供试土壤硝化作用模式 Table.2 The model analysis of nitrification with the experimented soil

表2 供试土壤硝化作用模式 Table.2 The model analysis of nitrification with the experimented soil 处理 Logistic模型 最大硝化速率Kmax/(mg·kg-1·d-1) 达到最大硝化速率的时间t0/d 最大硝化潜势Np/(mg·kg-1) R2S 指数模型 RJ2 增长模式 注: y为NO-3-N累积量(mg · kg-1);x为培养时间(d). CK N=732/(1+e2·e-0.219t) 40.08 14 732 0.895 y =71.201e0.1552x 0.883 R2S>RJ2 NB0 N=1724/(1+e2·e-0.110t) 47.40 20 1724 0.656 y =209.36e0.770x 0.473 NB0.02 N=1003/(1+e2·e-0.335t) 84.02 5 1003 0.808 y =243.16e0.1001x 0.761 NB0.05 N=1434/(1+e2·e-0.273t) 97.89 7 1434 0.878 y =264.12e0.1131x 0.774 NB0.1 N=1292/(1+e2·e-0.099t) 97.55 6 1292 0.863 y =278.33e0.1072x 0.816

添加硫酸铵后各处理土壤pH值有所降低，但变化不一致(图 1c)，NB_0.05和NB_0.1处理在培养期间1~14 d土壤pH比较稳定，其余3个处理随时间延长土壤pH逐渐下降，总的趋势为：NB_0.1(5.53~6.17)>NB_0.05(5.02~5.75)> NB_0.02(4.54~5.16)>CK(4.12~4.96)>NB₀(4.32~4.74)，硝化作用一般随土壤pH值升高而增强，这可能是NB_0.1处理和NB_0.05处理NO^-₃-N累积量较高的原因之一.

土壤性质与K_max、t₀和N_p的相关分析结果见表 3.K_max与土壤pH、氨氧化细菌数量呈显著正相关(p＜0.05，n=5)，与NO^-₃-N呈极显著正相关(p＜0.01，n=5)，与土壤微生物生物量碳、氮呈极显著负相关(p＜0.01，n=5)，与土壤EC、WHC、CEC、氨氧化潜势和脲酶活性没有相关关系(p＞0.05，n=5).t₀与微生物生物量氮呈显著正相关(p＜0.05，n=5)，与氨氧化细菌数量呈显著负相关(p＜0.05，n=5)，与其它土壤因子没有相关关系(p＞0.05，n=5).N_p与脲酶活性呈显著正相关(p＜0.05，n=5)，与其它土壤因子没有相关关系(p＞0.05，n=5).综合K_max、t₀和N_p三者来看，土壤pH、氨氧化细菌数量、NO^-₃-N含量、微生物量碳氮、脲酶活性与土壤硝化作用关系密切.

表3(Table.3)

表3 土壤性质与Kmax、t0和Np的相关系数 Table.3 Correlation coefficient between soil properties and Kmax、t0 and Np

表3 土壤性质与Kmax、t0和Np的相关系数 Table.3 Correlation coefficient between soil properties and Kmax、t0 and Np   土壤酸碱度 Soil pH 土壤电导率 Soil EC 阳离子交换量 CEC 土壤 持水量WHC 铵态氮NH+4-N 硝态氮 NO-3-N 氨氧化潜势 NO-2-N 微生物生物量碳MBC 微生物生物量氮MBN 脲酶活性Urase activity 氨氧化细菌计数Population of ammonia oxidizing bacteria 注: *表示相关达到显著水平(p<0.05); **表示相关达到极显著水平(p<0.01); Note: * indicates significant difference at p<0.05; ** indicates very significant difference at p<0.01. 土壤酸碱度Soil pH 1 0.943* 0.929* 0.961** -0.357 0.741 -0.225 -0.814 -0.925* -0.061 0.896* 土壤电导率Soil EC   1 0.921* 0.980** -0.170 0.723 0.005 -0.647 -0.811 0.043 0.814 阳离子交换量CEC     1 0.930* -0.094 0.664 0.128 -0.733 -0.777 0.247 0.718 土壤持水量WHC       1 -0.325 0.618 -0.073 -0.631 -0.798 -0.071 0.784 铵态氮NH+4-N         1 0.130 0.813 0.154 0.325 0.900* -0.318 硝态氮NO-3-N           1 -0.134 -0.867 -0.879* 0.277 0.895* 氨氧化潜势NO-2-N             1 0.325 0.422 0.809 -0.449 微生物生物量碳MBC               1 0.937* -0.154 -0.883* 微生物生物量氮MBN                 1 0.074 -0.986** 脲酶活性Urase activity                   1 -0.130 氨氧化细菌计数Population of ammonia oxidizing bacteria                     1 Kmax 0.904* 0.803 0.823 0.771 -0.145 0.922* -0.258 -0.971** -0.977** 0.135 0.947* t0 -0.764 -0.624 -0.510 -0.607 0.441 -0.813 0.669 0.843 0.935* 0.300 -0.957* Np 0.128 0.233 0.471 0.170 0.733 0.213 0.858 -0.171 0.013 0.930* -0.096

生物炭稳定性碳含量高、C/N比大(Lehmann et al., 2003; Zavalloni et al., 2011)，呈碱性(Spokas et al., 2011; Yuan et al., 2011)，孔隙结构发达、有一系列不同的官能团(Taghizadeh-Toosi et al., 2012a，2012b; Clough and Condron， 2010; Nieder et al., 2011)，会影响土壤物理、化学和生物学性质以及硝化过程.相关分析表明土壤pH值与K_max存在显著正相关关系，与前人报道一致(王帘里和孙波，2011; 范晓晖等，2005; 孙波等，2009)，土壤pH是影响氨氧化细菌和/或氨氧化古菌群落结构、多样性和丰度的主要因素(王亚男等，2012; Nicol et al., 2008)，本试验也表明土壤pH值与氨氧化细菌数量呈显著正相关，施用石灰后土壤pH值由4.21升高到6.34，氨氧化细菌基因拷贝数显著增加(Barton et al., 2013)，土壤硝化作用增强.培养试验土壤初始NO^-₃-N与K_max呈极显著正相关，NO^-₃-N含量反映氨氧化过程，表明生物炭能促进氨氧化强度，这与生物炭处理在硝化培养试验结束后土壤NO^-₃-N含量较高，以及K_max较大的结果是一致的.

土壤微生物生物量碳、氮与K_max呈极显著负相关，与生物炭处理降低土壤微生物生物量碳、氮含量有关.研究表明生物炭显著降低微生物生物量碳含量、氮矿化量和净硝化速率(Dempster et al., 2012)，减少参与NH⁺₄氧化为NO^-₂微生物丰度(Andersona et al., 2011)，生物炭含有降低微生物数量和活性的易挥发性化合物可能是主要原因(Deenik et al.， 2010)，如乙烯(Spokas et al., 2010).氨氧化细菌数量与K_max存在显著正相关，与生物炭处理显著增加氨氧化细菌数量有关.生物炭处理amoA基因拷贝数显著高于未施生物炭的处理(Ducey et al., 2013)，添加5%~10%干土重生物炭的氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)基因拷贝数显著高于对照，但添加20%的显著降低(Song et al., 2014)，生物炭对微生物数量和活性的影响可能与原材料、加工工艺以及土壤性质等有关，氨氧化和/或硝化功能菌群对生物炭的响应机制还有待进一步研究.

N_p与脲酶活性呈显著正相关，说明脲酶活性强的土壤硝化作用也强.盆栽期间施用尿素，可能提高了脲酶活性，促进尿素水解转化为NH⁺₄，盆栽结束后脲酶与土壤NH⁺₄-N呈显著正相关.通过尿素水解作为氨的来源进行氨氧化作用是AOB适应酸性环境的一种机制，而且还分离到AOA Nitrososphaera viennensisi具有脲酶基因，能够利用尿素生长(Lu and Jia， 2013)，因此可以考虑将脲酶活性作为表征酸性土壤硝化作用强度高低的指标.施用生物炭的处理脲酶活性差异不显著，但K_max随生物炭用量的增加而增大，猜测与土壤中NH⁺₄/NH₃动态平衡有关，因为AOB的关键酶——氨单加氧酶(amo)只能催化NH₃，施用生物炭后土壤pH值升高，利于NH⁺₄/NH₃动态平衡向NH₃转化，可能促进了硝化作用，K_max增大.尽管施用生物炭增大K_max，但N_p是降低的，表明生物炭对酸性土硝化作用的促进作用是短期的，土壤pH 5.4的小麦地施用生物炭3个月和14个月后土壤净硝化速率和净硝化潜势与不施生物炭的对照没有显著差异(Castaldi et al., 2011)，生物炭对土壤养分转化和微生物生长起作用的时间短，需不断施用才能发挥其效应(Quilliama et al., 2012)，因此生物炭对酸性菜地土硝化作用具有促进效应还是抑制效应有待于长期田间试验结果加以验证.另外在土壤性质与硝化作用的关系方面本试验与前人研究结果存在不一致，有研究表明土壤CEC含量是影响最大硝化速率(鲍俊丹等，2011)或土壤硝化量(张树兰等，2002)的主要因素，但本试验结果没有相关性，需要针对不同土壤类型和种植体系作进一步研究.

1)土壤硝化模式呈“S”型变化，NO^-₃-N累积量随生物炭施用的增加而增加，生物炭能提高最大硝化速率、降低达到最大硝化速率的时间和最大硝化潜势，最大硝化速率明显升高是NO^-₃-N累积量增加的主要原因.

2)相关分析表明土壤pH、氨氧化细菌数量、NO^-₃-N含量、微生物生物量碳氮、脲酶活性与土壤硝化作用关系密切.

本研究结果为进一步开展硝化作用在酸性菜地土壤氮素转化的作用，以及制定酸性菜地+合理施用生物炭等具有重要意义.