生物强化废水处理系统功能的发挥与该系统中功能菌的数量和种类有直接的关系(Van Limbergen et al., 1998；Hall et al., 2002)，为了保证生物强化废水处理系统高效稳定的运行，在运用COD，BOD以及目标物质的去除效果来评价强化系统的同时，更需要对系统中功能菌数量的变化进行实时的检测.此项数据的准确把握将为实际应用中操作条件的优化，工艺性能的改进提供重要的理论依据.

传统的活菌计数法(CFU法)或最大然数计数法(MPN法)存在耗时，繁琐的缺陷，而且由于分离培养技术的限制，很难对培养条件苛刻的微生物进行研究(李久安等，2011；朱海霞等，2007).目前在对环境中特定微生物丰度的研究中，较多地应用Southern blot杂交技术(马丽华等，2005；王建龙，2003)，而应用Southern blot检测基因拷贝数则对操作要求高，工作量大(宣姚吉等，2009).近年来，荧光定量PCR技术的迅猛发展为检测废水处理系统中功能菌数量的变化提供了一个新途径.该方法可以通过定量表征功能菌中特征基因片段的数量来实时检测功能菌数量的变化.与上述方法相比，荧光定量PCR技术操作简便，快捷.具有很高的灵敏性和特异性，其在检测废水处理系统中特定功能微生物，如氨氧化细菌群、硝化菌群，硫酸盐还原菌群，产甲烷菌群等，或特异基因，如抗生素抗性基因，毒力基因等的数量动态变化方面也得到了较广泛的应用(Harms et al., 2003；Wang et al., 2012；Ben-Dov et al., 2007；Song et al., 2010；Volkmann et al., 2004；孙婷婷等，2013).

文中模拟了生物强化降解苯胺SBR反应器运行，降解菌采用实验室保存的pseudomonas otitidis strain JY9.通过特异引物设计，直接定位于该降解菌的功能基因片段C12O.研究不同苯胺浓度条件下，C12O数量变化及其与苯胺降解率和生物强化反应器运行过程中表征活性污泥有机生物量的重要指标MLVSS(混合液挥发性悬浮固体浓度)之间的关系.

苯胺降解菌Pseudomonas otitidis strain JY9由实验室筛选获得，该菌株现保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC NO.7787，大肠杆菌XL-Blue1，购自Invitrogen公司.

细菌基因组提取试剂盒(DP302)、PGM-T 连接试剂盒(VT202)、质粒小量快速提取试剂盒(DP103)、 胶回收试剂盒(DP204)、 荧光定量PCR酶RealMasterMix SYBR Green(FP202)均购自天根生化科技(北京)有限公司，低温冷冻离心机，荧光定量PCR仪(Bio-rad)和微量核酸定量仪Nanodrop2000 均购自thermo公司.

LB培养基:NaCl：10 g，酵母粉：5 g、蛋白胨：10 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.0.

无机盐培养基：无机盐培养基成分：Na₂HPO₄:2.52 g、KH₂PO₄:0.5 g、MgSO₄·7H₂O:0.4 g、(NH₄)₂SO₄:0.5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0.

根据Genbank网站中公布的假单胞菌属C12O基因序列保守区设计引物PHO-RTs和PHO-RTas 见表 1.引物合成由上海英潍捷基公司完成.

表1(Table 1)

表1 实验所用克隆C12O基因的引物序列 Table 1 Primers for cloning C12O used in this study

表1 实验所用克隆C12O基因的引物序列 Table 1 Primers for cloning C12O used in this study 引物 序列(5 ′-3′)扩增片段长度(bp)Tma PHO-RTs TTCACATCGTACATCACCT 299 58 ℃ PHO-RTas GAGACCACCTCCTTCATC 58 ℃

以苯胺降解菌Pseudomonas otitidis strain JY9菌株的基因组为模板，PHO-RTs和PHO-RTas为引物，扩增C12O基因.回收目的片段，16 ℃下与PGM-T载体连接，构建含C12O的标准质粒，转化感受态大肠杆菌XL-Blue1，37 ℃过夜培养，次日挑选白色菌落送检测序，测序正确的质粒即为标准质粒命名为T-PHO.

试剂盒法抽提质粒T-PHO，具体步骤参照说明书.用微量核酸定量仪测定其浓度，其浓度为67.4 ng · μL^-1，重组质粒序列大小接近3 Mb，计算其分子量为1.98×10⁶ Da，根据分子量和阿伏伽德罗常数(6.02×10²³ 分子数 · mol^-1)，计算其分子拷贝数为2.05×10^-8 拷贝 · μL^-1.将质粒作十倍梯度稀释，稀释成10~10⁶ 个拷贝 · μL^-1，分别以1μL各质粒浓度作为模板，以PHO-RTs和PHO-RTas为引物进行荧光定量PCR.每个浓度重复3次实验.以仪器软件给出的Ct值作为纵坐标，起始模板中质粒拷贝数的对数作为横坐标，建立标准曲线.

反应体系和反应条件：反应体系为20 μL，SYBR Green Realtime PCR Master 10μL，DNA模板1 μL，引物各0.8 μL(10 μmol · L^-1)，ddH₂O 7.6 μL. 反应条件：预变性：95 ℃变性4 min，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共35个循环.

SBR反应器为有机玻璃制成，如图 1所示，有效容积1.5 L，共采用6个相同的反应器，其对应的反应器编号为SBR-AS0—SBR-AS5.反应器内设曝气头，曝气量1 L · min^-1，保持环境温度25.0 ℃±0.5 ℃.由于反应器较小，进排水时间基本可以忽略.反应器运行周期：沉淀时间1 h，曝气时间10 h，闲置时间0.5 h，进水后静止0.5 h，每个周期12 h，每天两个运行周期.

图 1(Fig. 1)

图 1 实验用SBR装置(1.曝气泵；2.流量计；3.曝气头；4.SBR反应器；5.取样口) Fig. 1 SBR reactor used in study(1.Aeration pump; 2.Flowmeter; 3.Aeration tap; 4.SBR reactor; 5.Sampling port)

试验用活性污泥取自成都第二污水处理厂二沉池的回流污泥，向6个SBR反应器中加入活性污泥.采用人工配制废水对其做短期驯化.人工配制废水成分为：蔗糖：600 mg · L^-1、KH₂PO₄：30 mg · L^-1、NaHCO₃:400 mg · L^-1、NH₄Cl:75 mg · L^-1、酵母膏：20 mg · L^-1、MgSO₄： 250 mg · L^-1.系统运行稳定后向SBR-AS2—SBR-AS5中加入一定量的苯胺，使其终浓度依次为200、300、400、500 mg · L^-1.与此同时，苯胺降解菌Pseudomonas otitidis strain JY9经添加苯胺的无机盐培养基活化24小时，当OD₆₀₀值接近于1时，按照体积分数2%接种量分别等量地接种到SBR-AS1—SBR-AS5反应器中.

研究过程中设置两个空白对照SBR-AS0和SBR-AS1，其中SBR-AS0为不接种苯胺降解菌Pseudomonas otitidis strain JY9，并向其中添加终浓度为200 mg · L^-1的苯胺；SBR-AS1接种苯胺降解菌Pseudomonas otitidis strain JY9，接种量如上所述，但不向其中添加苯胺.

混合曝气阶段取泥水混合物10 mL，15000 r · min^-1离心15 min，弃上清，准确称取新鲜污泥200 mg，总DNA提取方法参照文献(Boon et al., 2000).1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA片段.

苯胺浓度测定采用高效液相色谱法，具体参数设置参照文献(Ahmed et al., 2010)，MLVSS(混合液挥发性悬浮固体浓度)的测定参考文献(李晓雁等，2009).

标准曲线共设置3次重复，每次重复R²均大于0.994，标准曲线的斜率为-3.14±0.06(图 2所示)，变异系数1.91%.标准曲线C_t值标准偏差为0.13~0.34，变异系数为1.11%~2.78%(表 2所示).表明所建立的标准曲线具有较好的重复性和精确度.

图 2(Fig. 2)

图 2 荧光定量PCR检测C12O的标准曲线 Fig. 2 St and ard curves of C12O monitored by real-time PCR

表2(Table 2)

表2 标准曲线的重复性 Table 2 Reproducibility of st and ard curves

表2 标准曲线的重复性 Table 2 Reproducibility of st and ard curves DNA量/ (拷贝数·μL-1) Ct值 SD CV C12O基因 1 2 3 106 9.18 9.00 8.94 0.13 1.38% 105 12..85 12.42 12.98 0.29 2.30% 104 16.82 16.69 16.33 0.25 1.52% 103 18.81 19.37 19.65 0.14 2.78% 102 22.17 22.54 22.13 0.25 1.11% 101 25.86 25.37 25.21 0.34 1.32%

如图 3所示，当苯胺终浓度在200~500 mg · L^-1范围内，苯胺降解率在一个运行周期内均不受明显影响.降解率均在96.0%以上.而在空白对照SBR-AS0反应器中，苯胺降解率仅为11.94%(表 3).显示了苯胺降解菌Pseudomonas otitidis strain JY9在苯胺快速降解过程中所起的关键作用.

图 3(Fig. 3)

图 3 苯胺浓度对降解率的影响 Fig. 3 Aniline degradations rate under different concentrations

表3(Table 3)

表3 SBR反应器运行指标考察及C12O定量拷贝数 Table 3 Operation indicators of SBR reactor and copies of C12O

表3 SBR反应器运行指标考察及C12O定量拷贝数 Table 3 Operation indicators of SBR reactor and copies of C12O 反应器编号 进水苯胺浓度 / (mg·L-1) 出水苯胺浓度 / (mg·L-1) 苯胺去除率 MLVSS / (mg·L-1) C12O/ (拷贝数·mg-1(MLVSS)) SBR-AS0 200 176.13 11.94% 780   SBR-AS1 0 0   1970 4.2×103 SBR-AS2 200 9.92 97.2% 2790 1.8×106 SBR-AS3 300 15.56 96.1% 2480 5.4×107 SBR-AS4 400 18.17 96.0% 2570 9.2×108 SBR-AS5 500 13.26 97.4% 2630 2.7×109

利用上述实时荧光定量PCR检测SBR系统活性污泥在不同苯胺浓度下C12O数量和MLVSS的变化.如图 4和表 3所示，随着在一定范围内苯胺浓度的逐渐升高，C12O的数量在显著上升，变化范围从1.8×10⁶ mg^-1 到2.7×10⁹ mg^-1.然而在空白组SBR-AS1中，C12O的拷贝数仅有4.2×10³个，与存在苯胺的反应器中的数量相差3到6个数量级.表明一定浓度范围内的苯胺对SBR系统中C12O拷贝数量的提升有较强的促进作用，并且更高的C12O拷贝数保证了高浓度苯胺的快速降解.当苯胺浓度在200~500 mg · L^-1范围内，活性污泥中的MLVSS维持在2480~2790 mg · L^-1的稳定水平，与空白组SBR-AS1的MLVSS相比较，微生物量的变化较为显著.间接表明苯胺降解菌Pseudomonas otitidis strain JY9在苯胺降解过程中数量上得到了显著的增长.而空白组SBR-AS0的结果表明，在不存在苯胺降解菌Pseudomonas otitidis strain JY9的条件下，苯胺无法得到有效的降解，并且一定浓度的苯胺显著降低了活性污泥当中的微生物量.这部分归因于苯胺具有极强的生物毒性，在缺乏高效降解苯胺的功能菌时，高浓度的苯胺抑制了活性污泥中其他功能微生物的生长.

图 4(Fig. 4)

图 4 不同苯胺浓度下C12O拷贝数及MLVSS变化情况 Fig. 4 C12O copies and change of MLVSS under different aniline concentrations

文中通过特异性引物的设计，直接定位于苯胺生物强化SBR反应器中所投加Pseudomonas otitidis strain JY9的功能基因C12O.并建立了C12O的 RT-PCR检测体系，并且该体系具有较好的重复性，检测周期较短.该方法的建立为检测生物强化反应器中功能菌数量的变化提供了一定的参考.

随着SBR反应器中苯胺浓度的增加，C12O的拷贝数也在显著增加，高浓度苯胺的完全降解依赖于C12O数量的增加，而单个细胞的C12O拷贝数是固定的，因此，在实际应用中可以考虑向生物强化反应器中投加更多的功能菌剂来快速处理更高浓度的目标污染物.

SBR反应器中活性污泥MLVSS的数值可表示活性污泥微生物量(Arbuckle and Griggs，1982；Li et al., 2005).实验结果表明降解菌(Pseudomonas otitidis strain JY9)的投加在稳定活性污泥中微生物量的过程中发挥了一定作用，在SBR-AS0反应器中由于受到苯胺的冲击并且没有投加高效降解苯胺的功能菌，活性污泥中MLVSS明显下降，这可能部分归因于苯胺较强的生物毒性作用.

随着SBR反应器中苯胺浓度的逐渐升高，每单位(mg)MLVSS中C12O的数量在显著上升，由于C12O拷贝在Pseudomonas otitidis strain JY9单细胞中的数量是固定的，一定程度上表明Pseudomonas otitidis strain JY9在MLVSS中的比重显著增加，当反应器运行稳定时，苯胺降解菌Pseudomonas otitidis strain JY9逐渐成为反应系统活性污泥当中的优势菌.有学者(Boon et al., 2003)在研究3-氯苯胺冲击条件下，采用直接投菌的生物强化技术来保护活性污泥微生物群落的功能和结构时也发现，随着3-氯苯胺的持续冲击，DGGE图谱显示8 d之后，功能菌Comamonas testosteroni 12 gfp在污泥系统中成为优势菌，并且反应系统当中的硝化菌群代谢活力没有受到明显影响.本文的实验结果在一定程度上也符合了上述事实.

1)建立了生物强化苯胺降解SBR反应器中特征功能基因C12O荧光定量PCR检测方法.为探究功能菌投加到反应器后，其存在状况与数量变化情况提供了重复性好，较为可靠的检测手段.

2)随着反应器中苯胺浓度的逐渐升高，每单位(mg)MLVSS中，C12O拷贝数量在显著上升.高浓度苯胺的完全降解依赖于反应器中较高的C12O拷贝数.

3)在反应系统受到苯胺冲击时，苯胺降解菌的投加能够稳定活性污泥中的MLVSS，当含有高浓度苯胺废水系统运行稳定时，降解菌Pseudomonas otitidis strain JY9逐渐成为活性污泥当中的优势菌.