镉(Cd)是一种广泛传播的重金属污染物，具有较长的半衰期，可通过施磷肥、采矿或者工业生产等所产生.由于其具有高度的水溶性，因此，土壤中的Cd非常容易被植物根系所吸收，经木质部运输到地上部分的叶片和果实中，进而进入食物链，对生态环境和人类健康均造成了严重的威胁(Bernard，2008).即使在低浓度时，Cd对大多数植物都是有毒性的，当叶片中Cd含量大于5~10 μg · g^-1时，就会导致植物死亡(Verbruggen et al., 2009).植物Cd中毒主要表现为生长发育迟缓、叶片失绿黄萎、叶绿体超微结构破坏、CO₂固定过程中的酶失活、光合作用抑制、花粉萌发和花粉管的生长受阻，以及导致N和S代谢紊乱(Anjum et al., 2008；Gill et al., 2012).此外，Cd过量还会扰乱抗氧化防御系统，引起活性氧(ROS)O^{- ·}₂、H₂O₂和OH^{- ·}等的积累，从而导致氧化胁迫(Sanita et al., 1999).研究发现，植物体已经进化出不同的耐Cd机制，包括与细胞壁结合、植物络合素(PCs)的解毒作用、Cd区域化集中在液泡中，或富集在叶表皮中等(Verbruggen et al., 2009；Gill et al., 2013).其中，由氧化胁迫诱导的抗氧化防御系统发挥着重要作用.

一氧化氮(NO)是植物中的一种多功能信号分子，几乎参与了植物所有的生长发育和对生物、非生物逆境的响应进程(Besson-Bard et al., 2008；Siddiqui et al., 2011).对植物体施加Cd胁迫后，能够激发内源NO的形成(Gill et al., 2013)，相反，适度的外源NO预处理可以明显缓解Cd胁迫下植物生理代谢的受阻和生长发育的抑制，并且伴随着剂量效应(Singh et al., 2008；Xiong et al., 2009)，这说明NO参与了植物应答Cd胁迫的信号转导(Laspina et al., 2005；Arasimowicz-Jelonek et al., 2011).考虑到NO在植物生理活动中的重要性，另加至今在高等植物基因组中仍未分离到动物中的NO合成酶(NOS)的同源序列，因此，对于植物体中NO的合成机制长期以来一直是植物生物学家探索的目标.目前已明确植物中除了具有类似于动物中的NOS 合成途径(即氧化途径)之外，还具有还原途径.亚硝酸根(NO^-₂)是还原途径的主要底物，它除了被酶促催化合成NO外，还能非酶促化学合成NO(Yamasaki，2000；Gupta et al., 2011).已知在酸性条件下，NO^-₂很容易得到质子(H⁺)，被还原成亚硝酸(HNO₂).通过一系列的反应，两分子的HNO₂会生成NO和NO₂，NO₂又可以转化成为NO和1/2O₂(Yamasaki，2000；Stöhr et al., 2002; Bethke et al., 2004).其中，抗坏血酸(Vc)、谷胱甘肽(GSH)和类胡萝卜素是常用的还原剂.这种来源的NO在植物体内常发生在无氧条件下，尤其是根系的质外体中.

外施NO抵抗Cd胁迫的研究主要用NO的供体硝普钠(SNP)和亚硝基谷胱甘肽(GSNO)等(Singh et al., 2008；Xiong et al., 2009)，但这些试剂价格昂贵，限制了其在生产中的应用.虽然在还原剂(Vc、GSH)存在条件下，NO^-₂可以释放出NO，并且已证明这种化学合成的NO也可以促进种子萌发等生理作用，但其在农作物抵抗非生物逆境中的应用研究还不多见(Stöhr et al., 2002; Bethke et al., 2004).考虑到还原剂存在条件下NO^-₂来源的NO不仅取材方便，而且价格低廉，具有潜在的生产推广价值.因此，本文以农作物玉米为材料，主要探讨Vc+NaNO₂所产生的NO对Cd胁迫下玉米幼苗生长发育的缓解作用，并从ROS代谢、膜脂过氧化、叶绿体色素的稳定性，以及TAST(酸溶性硫醇)、GSH和PCs(络合素)含量的变化等方面揭示可能的生理学机制，为进一步的大田应用奠定理论基础.

以“郑单958”玉米为试验材料，种子于2012年4月购自杨凌金诺种业公司.Vc和GSNO均购自Sigma公司，现用现配；NaNO₂购自西陇制药公司.

幼苗培养：玉米培养采用水培法，选择饱满且胚完整的种子，用3%H₂O₂消毒15 min，蒸馏水反复冲洗几次后在蒸馏水中浸泡过夜，使其充分吸胀；然后将种子放在底部铺有湿润滤纸的培养皿中于28 ℃恒温培养箱中发芽，待芽长到2~3 cm(约3~4 d)后，将种子移栽到含有不同浓度Cd的自来水中，置于光照培养间3 d，其中，光照强度为100 μmol · m^-2 · s^-1，光暗时间为14h/10h，昼夜温度为28℃/20℃，空气相对湿度70%；然后更换到Cd浓度分别为0、500、1000、2000、3000、4000和5000 μmol · L^-1 的1/2 Hoagl and 营养液培养中.4 d后对比生长势筛选出合适的Cd处理浓度.

NO溶液的制备：通过添加HCl或者NaOH将蒸馏水pH调整到4.5~6.0之间，随后加入浓度为10 mmol · L^-1的Vc，NaNO₂分别以0、500、1000、1500、2000、3000、4000和5000 μmol · L^-1的浓度加入到溶液中，其反应式为：C₆H₈O₆ + 2NO^-₂ + 2H⁺ = C₆H₆O₆ + 2NO + 2H₂O(Bethke et al., 2004).将不同浓度的NO与1000 μmol · L^-1的Cd同时浇灌于水培溶液中，分别于24 h、48 h、96 h及7 d后开始测定各个指标.

采用Francis等(1969)的方法进行幼苗地上部分株高、茎粗和叶面积测量，每组数据都测量了8个单独植株(或植株上的叶片)，取平均值.实验前后重复3次.

采用丙酮浸提法，用UV-2450型紫外可见分光光度计检测，分别在波长663、645和470 nm处测定吸光度值.

采用Elavarthi和Martin(2010)的分光光度法测定抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性.

O^{- ·}₂含量的测定根据Zhang等(2007)的方法，即在O^{- ·}₂存在时检测XTT的量.H₂O₂定量分析根据Brennan和Frenkel(1977)的方法，即根据415 nm波长下的吸光度值A₄₁₅，检测氧化钛复合物浓度，以不加根系样品为对照，用已知浓度H₂O₂作标准曲线.

采用赵生杰等(1994)的方法，即根据532 nm波长下的吸光度值A₅₃₂，检测TBA-MDA复合物浓度.

称取0.5 g左右的玉米根系，加入0.02 mol · L^-1 EDTA溶液5 mL，冰上研磨，12000 g下离心10 min，所得上清即为TAST.取2 mL上清与0.4 mol · L^-1 Tris缓冲液(pH=8.2)和0.1 mL 0.01 mol · L^-1 DTNB混合，加入3.95 mL甲醇，20 ℃保温10 min，在412 nm下比色.

GSH含量测定参照高俊凤(2006)的方法，PCs的含量为TAST含量与GSH含量的差值.

结果以3次试验的平均值±标准误表示，这些平均值在α=5%的水平上用DPS软件进行方差分析和新复极差法比较，用Origin软件做图.

对发芽3~4 d的玉米幼苗施加0~5000 μmol · L^-1的Cd胁迫，7 d后比较植株生长情况.如图 1所示，随Cd浓度的增加，植株生长受抑制越严重，具体表现为植株矮小，叶片卷曲、黄化；根部根毛数量急剧减少，颜色发黑，Cd浓度越高颜色越重.以浓度5000 μmol · L^-1 Cd处理最为严重，其叶片均为卷曲状，无法正常伸展开，其根部不仅成深黄色且发硬.在本研究的浓度范围内，可逆的浓度阈值为1000 μmol · L^-1，即解除胁迫后，玉米幼苗生长发育能够快速恢复(数据未显示)，故选择1000 μmol · L^-1为后续研究的胁迫浓度.

图 1(Fig. 1)

图 1 不同浓度Cd处理对玉米幼苗生长的影响 Fig. 1 Effect of different concentrations of Cd on the growth of maize seedlings

由图 2可知，10 mmol · L^-1 Vc与不同浓度的NaNO₂混合对1000 μmol · L^-1 Cd胁迫下玉米幼苗的生长具有剂量作用.处理7 d后，伴随NaNO₂浓度的不断增大，植株叶片黄化程度减轻，叶片数量有所增加，在2000~3000 μmol · L^-1 NaNO₂处理中达到最佳生长状态，之后又随NaNO₂浓度的增加黄化程度加剧，植株个头矮小，生长状态呈下降趋势.表 1显示了植株地上部分的形态指标株高、茎粗和叶面积都在3000 μmol · L^-1 NaNO₂处理时呈最大值，对照分别比其减少了41.17%、51.00%和72.99%，都达到了显著差异(p<0.05).

图 2(Fig. 2)

图 2 Vc+不同浓度NaNO2处理对1000 μmol · L-1 Cd胁迫7 d后玉米幼苗生长的影响 Fig. 2 Effect of Vc in addition of different concentrations of NaNO2 on the growth of maize seedlings under 1000 μmol · L-1 Cd stress for 7 days

表 1(Table 1)

表 1 Vc+不同浓度NaNO2处理对1000 μmol · L-1 Cd胁迫7 d后玉米幼苗形态指标的影响 Table 1 Effect of Vc in addition of different concentrations of NaNO2 on the morphological characteristics of maize seedlings under 1000 μmol · L-1 Cd stress for 7 days

表 1 Vc+不同浓度NaNO2处理对1000 μmol · L-1 Cd胁迫7 d后玉米幼苗形态指标的影响 Table 1 Effect of Vc in addition of different concentrations of NaNO2 on the morphological characteristics of maize seedlings under 1000 μmol · L-1 Cd stress for 7 days NaNO2/(μmol·L-1) 株高/cm 茎粗/cm 叶面积/cm2 0 17.46±1.85d 0.49±0.03f 1.78±0.52f 500 18.01±0.73d 0.59±0.02e 2.33±0.22e 1000 23.96±1.77c 0.64±0.02d 3.76±0.62d 1500 28.87±1.84a 0.71±0.04c 5.17±0.92b 2000 29.36±1.33a 0.90±0.04b 6.27±0.73a 3000 29.68±0.82a 1.00±0.03a 6.59±0.39a 4000 26.54±1.03b 0.92±0.03b 5.27±0.56b 5000 22.56±1.28c 0.89±0.04b 4.34±0.35c

叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，因此，叶绿素含量的多少能够反映植物叶片光合作用的强弱.10 mmol · L^-1Vc与不同浓度NaNO₂处理对1000 μmol · L^-1 Cd胁迫7 d后玉米叶片黄化作用的影响见图 3.同时，本文分别测定了10 mmol · L^-1 Vc与0、1000、3000、5000 μmol · L^-1 NaNO₂混合处理3、5和7 d时，叶片的叶绿素含量(图 4).由图 4可以发现，虽然在处理初期(3 d)，对照组和各处理组间的总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量(以FW计)就产生了明显差异，但差异最显著的是处理后期(7 d).说明当长时间Cd胁迫使对照的叶绿体色素含量显著降低时，Vc+ NaNO₂来源的NO能够维持叶绿体色素的相对稳定.这种效应也具有浓度依赖性，其中以3000 μmol · L^-1 NaNO₂的效果最好.

图 3(Fig. 3)

图 3 Vc+不同浓度NaNO2处理对1000 μmol · L-1 Cd胁迫7 d后玉米叶片黄化作用的影响 Fig. 3 Effect of Vc in addition of different concentrations of NaNO2 on the situation of maize leaves yellowing under 1000 μmol · L-1 Cd stress for 7 days

图 4(Fig. 4)

图 4 Vc+不同浓度NaNO2处理对1000 μmol · L-1 Cd胁迫玉米幼苗叶绿体色素含量的影响 Fig. 4 Effect of Vc in addition of different concentrations of NaNO2 pretreatments on chloroplast pigments content under 1000 μmol · L-1 Cd stress in maize seedlings

根系是植物吸收水分和营养的主要器官，根系的生长发育直接影响植株地上部分的生长状况.图 5显示，NO能不同程度地缓解Cd胁迫对玉米幼苗根系生长造成的伤害，与对照组相比，10 mmol · L^-1 Vc+1000 μmol · L^-1 NaNO₂既可以促进主根的伸长，又能够促进侧根的发育；NaNO₂浓度为3000 μmol · L^-1时，侧根发育达到最佳状态，其长度已快接近主根长度，但过高的NaNO₂处理浓度又会抑制根的生长和发育.

图 5(Fig. 5)

图 5 Vc+不同浓度NaNO2处理对1000 μmol · L-1 Cd胁迫3 d后玉米幼苗根系生长的影响 Fig. 5 Effect of Vc along with different concentrations of NaNO2 on the growth of maize roots that were exposed to 1000 μmol · L-1 Cd for 3 days

图 6a表明，在1000 μmol · L^-1 Cd胁迫24 h内，10 mmol · L^-1 Vc+不同浓度NaNO₂处理组较对照组SOD活性显著增高，1000、3000和5000 μmol · L^-1 NaNO₂处理组间相比，3000 μmol · L^-1NaNO₂处理组显著高于其他2个处理组，1000和5000 μmol · L^-1 NaNO₂处理组之间没有显著差异，即也具有浓度依赖性；随着处理时间的延长，各处理组的SOD活性均显著下降，但各处理组SOD活性绝对值均高于对照组，尤其在处理96 h后，对照组的SOD活性骤然降低，3个NaNO₂浓度的处理组的酶活分别高于对照68.7%、70.0%和50.5%.CAT(图 6b)、APX(图 6c)和GR(图 6d)的活性与SOD活性具有相似的规律.以上结果都说明Vc+NaNO₂来源的NO能够增强和优化Cd胁迫下玉米幼苗根系的抗氧化酶的活性.

图 6(Fig. 6)

图 6 Vc+不同浓度NaNO2处理对1000 μmol · L-1 Cd胁迫下玉米幼苗根部抗氧化酶活性的影响 Fig. 6 Effects of Vc in addition of different concentrations of NaNO2 pretreatment on antioxidant enzymes activity of maize seedlings under 1000 μmol · L-1 Cd stress

如图 7所示，在处理24、48和96 h期间，对照组玉米幼苗根系的H₂O₂、O^{- ·}₂和MDA含量(均以FW计)的变化基本一致，呈上升趋势；而10 mmol · L^-1 Vc+不同浓度NaNO₂处理组的O^{- ·}₂含量在胁迫后期变化平缓，1000和3000 μmol · L^-1 NaNO₂处理组的O^{- ·}₂含量略有下降；H₂O₂和MDA含量虽有所上升，但仍明显低于对照组.在胁迫96 h后，3000 μmol · L^-1 NaNO₂处理组较对照组的H₂O₂、O^{- ·}₂和MDA含量分别减少了28.5%、35.8%和37.1%，差异达到显著水平(p<0.05).

图 7(Fig. 7)

图 7 Vc+不同浓度NaNO2处理对1000 μmol · L-1 Cd胁迫幼苗根部H2O2、O- ·2和MDA含量的影响 Fig. 7 Effect of Vc in addition of different concentrations of NaNO2 pretreatments on hydrogen peroxide(H2O2)of maize seedlings，superoxide anion(O- ·2)production and malondialdehyde(MDA)

在本实验中，随着处理时间的延长，各处理组玉米根系的酸溶性硫醇(TAST)和谷胱甘肽(GSH)的含量(均以FW计)均呈稳步上升，在96 h达到最高值，且3000 μmol · L^-1 NaNO₂处理组的含量均显著高于其他处理组(表 2).所不同的是，TAST含量在胁迫后期上升明显，而GSH含量在胁迫中期就显著上升.对照组的TAST含量在胁迫期间基本不变，GSH含量则呈持续上升的趋势，处理中期时对照组GSH含量仍分别低于10 mmol · L^-1 Vc+1000、3000、5000 μmol · L^-1 NaNO₂处理组64.26%、69.16%和66.20%.络合素(PCs)含量为TAST和GSH之差，在同一处理时间下，各处理组的PCs含量均显著高于对照组的值.说明Vc+NaNO₂来源的NO能够显著提高玉米根系络合素的含量，增强植株解除重金属毒害的能力.其中，以10 mmol · L^-1 Vc+3000 μmol · L^-1 NaNO₂处理组的PCs含量最高，其PCs含量分别在胁迫期间比对照组高出了42.31%、30.17%和83.07%.

表 2(Table 2)

表 2 Vc+不同浓度NaNO2处理对Cd胁迫下玉米根系TAST、GSH和PCs含量的影响 Table 2 Effect of Vc in addition of different concentrations of NaNO2 pretreatment on the content of TAST，GSH and PCs of maize seedlings

表 2 Vc+不同浓度NaNO2处理对Cd胁迫下玉米根系TAST、GSH和PCs含量的影响 Table 2 Effect of Vc in addition of different concentrations of NaNO2 pretreatment on the content of TAST，GSH and PCs of maize seedlings Cd处理时间/h NaNO2浓度/(μmol·L-1) TAST含量/(nmol·g-1) GSH含量/(nmol·g-1) PCs含量/(nmol·g-1) 24 0 251.25±7.86c 20.67±1.15c 230.58±6.72c 1000 339.96±14.31b 36.04±5.13b 303.92±11.88b 3000 370.34±4.04a 42.21±3.95ab 328.14±6.50a 5000 331.51±10.96b 41.35±0.83a 287.41±9.79b 48 0 287.37±3.60c 30.83±4.02c 256.54±7.19c 1000 393.40±12.59b 86.27±3.74b 307.13±13.79b 3000 433.90±7.49a 99.96±12.79a 333.68±5.62a 5000 411.40±14.10b 91.22±4.20ab 320.19±10.13ab 96 0 268.72±3.45c 50.27±8.46b 218.45±10.51c 1000 482.89±3.38b 109.53±1.98a 373.37±5.04b 3000 512.54±17.51a 112.63±4.96a 399.90±13.37a 5000 485.67±14.30b 105.08±5.96a 380.59±20.17ab

植物对Cd胁迫的抗性牵涉到许多响应进程的整合网络，其中，抗氧化防御能力与Cd抗性成正相关.尽管最近几年在此领域取得了很大进展，但诸如植物Cd响应的具体的信号转导机制和基因表达的调控仍不是很清楚.正因为如此，调节植物不同生理进程(包括保护Cd诱导的毒性)的NO信号分子得到了广泛的关注.大量研究表明(Laspina et al., 2005；Singh et al., 2008；Xiong et al., 2009；Arasimowicz-Jelonek et al., 2011; Zhang et al., 2012)，外源NO可以减缓由Cd引起的氧化胁迫.其一，NO自身具有抗氧化剂性质，可以直接清除O^{- ·}₂和ONOO^-；其二，NO能够激活抗氧化酶，如SOD、CAT、APX和GR等，间接清除ROS，即NO通过调节ROS毒性的水平在细胞保护中发挥着重要的作用，以此来阻止植物受到氧化损伤.本研究发现，化学合成的NO^-₂来源的NO甚至能够使玉米幼苗避免遭受高达1000 μmol · L^-1 Cd毒害，这比Singh等(2008)报道的NO供体SNP所发挥作用的Cd浓度上限300 μmol · L^-1还要高几倍.而且我们发现此来源的NO也能显著增加Cd胁迫下玉米幼苗根系的抗氧化酶SOD、CAT、APX和GR的活性，相反降低了H₂O₂和O^{- ·}₂的净含量，减小了膜脂的过氧化伤害，维持了叶绿体色素的稳定，进而缓解了对植株生长发育的抑制.这与用SNP作为外源NO供体在水稻叶片(Hsu et al., 2004)、向日葵叶片(Laspina et al., 2005；Saxena et al., 2013)、小麦根系(Groppa et al., 2008；Singh et al., 2008)、大麦幼苗(Chen et al., 2010)及芸薹属植物(Verma et al., 2013)上的结果一致.本研究中外源NO处理缓解了Cd胁迫对玉米幼苗根系生长的抑制，可能是因为NO优化了抗氧化防御能力进而减少根系中生长素降解的缘故(Xu et al., 2010).

除了在 Cd胁迫的缓解中起抗氧化防御的功能之外，NO还充当引起基因表达变化级联事件的信号分子，诱导Cd响应相关基因的表达.其中，PCs是最为常见的植物固定重金属的螯合肽，它具有较低的分子量，可以与各种金属离子形成硫醇结合蛋白(Maestri et al., 2010).PCs的合成是从GSH的γ-谷氨酰半胱氨酰二肽转肽而来(Gupta，2010).Kim等(2009)研究发现，PCs含量的增加可能是因为植物体内的抗氧化剂GSH含量的增加.而对植物体施加NO就能够促进GSH含量的增加，这是因为NO会与植物体内的GSH结合，启动植物体抗胁迫机制.Estrella-Gomez等(2009)对水生蕨类植物水槐(Salvinia minima)的耐Pb性的研究发现，NO能够促进PCs固定Pb²⁺的能力；Gadapati和Macfie(2006)研究发现，芥菜(Brassica juncea)会通过增加体内PCs的生物合成来增强自身抗Cd的能力；还有研究者证实，PCs能够降低植物体内Cd胁迫诱导产生的ROS含量，提高重金属耐受力((Mishra et al., 2006).本文通过测定1000 μmol · L^-1 Cd胁迫下，化学合成NO对玉米根系TAST、GSH和PCs含量变化的影响，发现随着胁迫时间的延长，NO对三者的含量都有促进作用，其中以10 mmol · L^-1 Vc+3000 μmol · L^-1 NaNO₂最为显著.说明化学合成的NO能够增强植物螯合重金属的能力，固定重金属离子，避免伤害延续，对Cd胁迫起到了缓解作用，这与前人的研究结果基本一致(Xiong et al., 2009).

本文主要从玉米幼苗的生长发育和生理代谢方面探讨了由Vc+NaNO₂合成的NO对Cd胁迫的缓解作用，同时证明了此来源的NO也能增强玉米幼苗的抗旱性，说明这种来源的NO在玉米抵抗非生物逆境中可能具有普遍作用.当然正如NO分子依赖于浓度和细胞定位的不同，可以在细胞中引起有益和有害两方面的作用，本研究发现，NO^-₂来源的化学合成的NO在缓解玉米幼苗Cd毒性方面也具有浓度依赖性.如前所述，低浓度的外源NO可能通过解除ROS引起的氧化胁迫而增强植物的Cd抗性，相反，高浓度的NO可能引起根部活性氮(Reactive Nitrogen Species，RNS)含量的增加，从而对植物体造成硝化胁迫(Corpas et al., 2011; Siddiqui et al., 2011; Saxena et al., 2013).因此，在具体应用中的浓度非常重要.本研究以水培条件下玉米幼苗胁迫症状可逆的最大Cd浓度1000 μmol · L^-1为处理浓度，发现解除Cd胁迫的最有效NO^-₂浓度为3000 μmol · L^-1，那么自然条件下的使用浓度如何，还需进一步去探索.此外，由于根系和叶片NO的来源不尽相同(Lux et al., 2011)，所以还需进一步揭示根施和叶喷施NO对缓解Cd胁迫的差异.总之，将来的研究重点应该放在NO^-₂来源的化学合成的NO对作物农艺性状的影响及在大田中的残留情况，建立适用于大田条件的技术体系(包括适用时期、使用浓度和使用部位等).

1)抗坏血酸存在条件下，NO^-₂以浓度依赖的方式缓解了Cd对水培玉米幼苗生长发育的抑制效应，NO^-₂ 的最佳浓度范围为2000~3000 μmol · L^-1.

2)抗坏血酸存在条件下，NO^-₂通过优化玉米幼苗根系酶促抗氧化防御系统，进而降低ROS的迸发和膜脂的过氧化而抵御Cd胁迫.

3)抗坏血酸存在条件下，NO^-₂通过维持叶绿体色素(叶绿素总量、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素)含量的相对稳定，有效地缓解了叶片的失绿黄化现象.

4)抗坏血酸存在条件下，NO^-₂通过增加玉米根系的TAST和GSH含量，进而增加金属螯合素的含量来减轻Cd的危害.