随着石油的大规模开采，聚合物驱作为有效的3次采油技术得到了大规模的应用，同时也产生了大量的含聚丙烯酰胺(HPAM)的采出水.由于含聚污水粘度大，难生物降解(严忠等，2009；陈婧等，2008)，所以很难达到当地的处理标准，易打破水回收系统的平衡(韩昌福等，2006)，并且产生昂贵的处理费用(Bao et al., 2010a).外排污水中的HPAM由于不能被完全降解而在环境中不断累积，进而造成对环境的污染，以及对人类健康的潜在威胁.因此，对含聚污水的处理已经成为保证油田可持续发展亟待解决的问题.

国内外有许多关于好氧法处理含聚污水的报道.例如，Wen等(2010)报道，从活性污泥和受到石油污染的土壤中分离出2株好氧菌，它们可以利用HPAM作为唯一的碳源；孙晓君等(2005)研究发现，好氧颗粒污泥对聚合物驱采出水具有良好的适应性，并能有效地促进HPAM的生物降解，但并没有达到理想的降解效果.因此，为了寻找一个有效降解含HPAM污水的方法，本文拟对厌氧生物法处理含HPAM污水进行研究.

作为一个特定的厌氧反应器，ABR由于具有设计简单、稳定性高、耗能低和处理效果好等特点(Liu et al., 2011；马溪平， 2005，Barber et al., 1999)而被广泛应用于试验中.例如，Ji等(2009)研究了ABR处理高盐度低营养的重油采出水的效果，Zhu等(2008)探讨了ABR处理大豆蛋白加工废水的性能.除此之外，ABR还被用于处理含四价铬的酸性废水(Sahinkaya et al., 2012)、含聚乙烯醇废水(Liu et al., 2011)、酸性矿排水(Bayrakdar et al., 2009; Sahinkaya et al., 2010; Bekmezci et al., 2011)、威士忌酒厂废水(Akunna et al., 2000)等.但关于用ABR处理高浓度含HPAM污水的报道却很少见.

课题组前期对HPAM的性质及好氧生物法降解HPAM开展了大量的研究，结果表明，好氧生物法能够有效地降解HPAM(Bao et al., 2010a；2010b；包木太等，2011；2009；2008；王海峰等，2009).基于此，本文进一步研究了厌氧生物法处理高浓度含HPAM污水的效果，并对HPAM降解菌的降解条件进行优化.同时，利用ABR对含HPAM污水的处理进行扩大化实验研究，以得到更好的降解效果，为处理含HPAM污水提供一个有效的方法.

选取实验室低温保藏的2株HPAM降解菌PAM-F1和PM-2进行实验.接种污泥取自青岛市某废水处理厂生物处理二沉淀池.污泥呈棕褐色，粒径为1~2 mm，总悬浮物(MLSS)为21.8 g · L^-1，挥发性悬浮物(MLVSS)为12.35 g · L^-1，污泥沉降指数为31.19.

实验用模拟污水：HPAM(相对分子量2.2×10⁷，水解度23%，固含量90%)500 mg · L^-1，用葡萄糖调节COD_Cr值至1500~1700 mg · L^-1.添加氮源(NH₄Cl)、磷源(磷酸二氢钾)，使COD_Cr ∶ N ∶ P=300 ∶ 5 ∶ 1，用NaHCO₃调节进水pH为7.0~7.5.除此之外，配水中还添加了镁离子、铁离子、锰离子等微生物生长所需的微量元素(Grobicki et al., 1991).

富集培养基(g · L^-1)：蛋白胨5，牛肉膏10，NaCl 5，去离子水1000 mL.降解培养基(g · L^-1)：HPAM 0.5，NH₄Cl 1.0，MgSO₄ · 7H₂O 2.0，NaSO₄ 2.0，CaCl₂ 0.05，NaH₂PO₄ 3.0，K₂HPO₄ 3.0，pH值调节至7.0~7.5，去离子水1000 mL.所有的培养基均在121 ℃下灭菌20 min后使用.

降解菌在250 mL的厌氧瓶中进行富集培养，35 ℃下富集培养2 d后，取5 mL的富集菌液接种到装有100 mL降解培养基的250 mL厌氧瓶中，35 ℃下培养7 d后，再取出5 mL的降解培养液接种到100 mL新鲜的降解培养基中培养7 d.30 d内不断重复这个驯化过程，得到驯化好的降解菌，待用(Bao et al., 2010b).所有的厌氧瓶在加入培养基后，通氮气5 min，以去除溶解氧，保证厌氧的环境.

菌株PM-2已经被实验室其他研究人员(陈庆国，2009)鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus sp.).所以，为了更好地了解菌株PAM-F1的特性，通过生理生化特征和16S rDNA测序分析对其进行菌种鉴定(Tu et al., 2013;周本军等，2013).

实验所用的ABR采用有机玻璃加工订做而成，规格尺寸为650 mm×150 mm×500 mm(长×宽×高)，有效容积约为35.5 L.反应器由5个隔室组成，前4个隔室为降解隔室，第5隔室为沉降室.前4个隔室中设有上流室和下流室，其宽度之比为4 ∶ 1，折流板底部转角为40°.4个隔室的顶部设有集气孔便于收集反应产生的气体，并在各个隔室底部两端设计倒角，既便于水流通往上流室中部，又避免“死区”出现.在隔室侧面设有取污泥口和取水口，便于定期监测反应器内污泥及污水变化情况.第5个隔室设有回流孔，用于污水的回流，有利于提高反应器的工作效率.由蠕动泵在ABR的进、出水端均匀进水和出水.ABR实验装置示意图如图 1所示.

图 1(Fig. 1)

图 1 厌氧折流板反应器示意图 Fig. 1 Schematic Diagram of Anaerobic baffled reactor

HPAM的浓度采用淀粉-碘化铬法测定(Lu et al., 2002)，COD_Cr采用重铬酸钾法测定(国家环保局，2002)，其中，HPAM生物降解率η₁和COD_Cr去除率η₂的计算公式为：

HPAM干粉和降解产物分析采用红外光谱法，取适量样品，KBr压片，用德国布鲁克Tensor27傅里叶-红外光谱仪分析.

从ABR反应器中取出反应后的颗粒污泥，进行扫描电镜分析.对反应前后的颗粒污泥进行前处理，方法见文献(Bao et al., 2010a).用S3400型扫描电镜观察污泥的形态结构变化.

PAM-F1菌株为短杆菌，有鞭毛，在富集培养基表面菌体呈现橘红色菌落，菌落湿润、中间凸起、形状规则.在革兰氏染色试验、明胶试验和葡萄糖试验中呈阳性，V-P试验和甲基红试验呈阴性.经测序后获得1486 bp的PAM-F1的16S rDNA序列，将PAM-F1的基因序列上传至GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得GenBank登录号为KC476501.1.并与已有的序列进行Blast基因比对，结果见表 1.综合生理生化特征和16S rDNA序列分析结果，确定PAM-F1为红球菌(Rhodococcus sp.).

表1(Table 1)

表1 PAM-F1基因比对结果 Table 1 The BLAST results of 16s rDNA of PAM-F1

表1 PAM-F1基因比对结果 Table 1 The BLAST results of 16s rDNA of PAM-F1 Gene Bank登记号 同源性评分 最大相似度 AY114109.2 2739 99% EU167912.1 2739 99% EF028124.1 2739 99% AY247275.1 2739 99% FJ752527.1 2737 99% FJ529024.1 2728 99% EF494198.1 2728 99% AY927223.1 2724 99% JN595857.1 2723 99% FJ529043.1 2723 99% EU697084.1 2723 99% EF634456.1 2723 99%

将两株单独菌和混合菌的培养液分别按10%的接入量接入到100 mL的降解培养基中，在35 ℃的生化培养箱中培养，间隔一定时间测定HPAM的浓度.从图 2中可以看出，在反应前3 d，HPAM的降解效果不是很明显.但从第4 d开始，随着降解时间的延长，HPAM的降解率迅速增加，到达第9 d以后，降解率趋于平缓.这是由于开始阶段厌氧菌生长缓慢，对HPAM的降解效果不明显.随着时间的延长，菌种逐渐适应环境，开始快速生长，降解率也开始增高.但随着对底物的消耗，厌氧菌的生长受到抑制，降解率增长缓慢，最后趋于平缓，从而得到9 d为最佳降解时间.

图 2(Fig. 2)

图 2 降解时间对聚丙烯酰胺降解率的影响 Fig. 2 Effect of degradation time on HPAM degradation efficiency

温度是影响微生物生命活动的重要因素，影响着酶的活性和酶促反应速率(石成春，2010)，而适宜的培养温度可使微生物以最快的速率生长繁殖.将驯化好的培养液按10%的量分别接入到100 mL的降解培养基中，分别在10、15、20、25、30、35、40、45 ℃的条件下培养，7 d后测定降解效果.由图 3可知，10~40 ℃时，HPAM的降解率不断增加，当温度超过40 ℃时，降解率明显降低.且在35~40 ℃之间，降解效果明显，40 ℃时，HPAM降解率最高，可达37.26%.因此，35~40 ℃为最适宜降解温度范围.

图 3(Fig. 3)

图 3 温度对HPAM降解率的影响 Fig. 3 Effect of temperature on HPAM degradation efficiency

厌氧微生物的生命活动、代谢过程与环境的pH值密切相关.pH通过影响细菌细胞膜的通透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响细菌的生长速率.每种微生物都有最适宜生长的pH范围，大多数微生物最适宜的pH范围为6.5~7.5.将驯化好的培养液按10%的量接入到100 mL降解培养基中，分别将pH值设定为3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0，在35 ℃的恒温培养箱中培养7 d后测定HPAM的浓度.由图 4可知，pH在6.0~9.0之间时，HPAM能够有效地降解，而最佳降解pH大约在7.0~7.8之间.当pH低于7.0或者高于7.8时，HPAM的降解率大幅度降低.当pH为7.5时，降解率达到最大值37.69%.

图 4(Fig. 4)

图 4 初始pH值对HPAM降解率的影响 Fig. 4 Effect of initial pH on HPAM degradation efficiency

将不同活化次数的培养液按10%的量接入到100 mL降解培养基中，在35 ℃的恒温培养箱中培养7 d后测定HPAM的浓度.如图 5所示，活化3次的培养基中，HPAM的降解效果最好，降解率可达35.7%.因此，确定最佳活化次数为3次.

图 5(Fig. 5)

图 5 活化次数对HPAM降解率的影响 Fig. 5 Effect of continuous activating time on the HPAM degradation efficiency

将活化3次的培养液按10%的量接入到100 mL的pH=7.5的降解培养基中，40 ℃下培养9 d后测定HPAM的浓度.如图 6所示，在最佳条件下，对于500 mg · L^-1的HPAM溶液，PAM-F1和PM-2对HPAM的降解率分别为36.14%和37.75%，而混合菌的降解效果更好，降解率可达40.69%.这可能是两株菌协同作用的结果(Bao et al., 2010b; Das et al., 2007).厌氧瓶实验表明，厌氧法能够有效降解HPAM污水.

图 6(Fig. 6)

图 6 最优条件下不同菌株的降解效果 Fig. 6 HPAM degradation efficiencies of different strains under the optimum conditions

分别对厌氧瓶实验中生物降解前后的HPAM进行傅里叶-红外光谱扫描，结果如图 7所示.HPAM作为一种伯酰胺，在3330 cm^-1和3190 cm^-1处的吸收峰分别对应于—NH₂键的反对称峰和对称伸缩振动峰(张华，2005)，而1660 cm^-1处的吸收峰对应于—CONH₂中C O键的对称伸缩振动峰(方道斌等，2006).对比图 7可以看出，厌氧生物降解后，2903 cm^-1左右的亚甲基反对称吸收峰(陈和生等，2011)消失，1679 cm^-1处酰胺I(C O)伸缩振动峰的吸收强度变弱，说明微生物在生长过程中利用了HPAM上的部分碳作为其生长所需的碳源.而降解产物的谱图中，3479 cm^-1和3413 cm^-1处游离—NH₂特征吸收峰强度增强，3280 cm^-1处缔结—NH₂特征吸收峰强度减弱，说明厌氧生物降解了HPAM上的部分胺基.而且1166 cm^-1和1114 cm^-1处的吸收峰强度明显减弱，这与C—N伸缩振动有关，说明厌氧生物降解后酰胺基的含量明显减少，从而进一步证明：微生物能够降解并利用HPAM上的部分胺基和碳作为其生长所需的氮源与碳源.也由此推断出，HPAM的降解是发生在水解酸化阶段.而通常参与水解酸化的细菌比较容易培养，其增值速率也快，这也与文中最佳降解时间仅为9 d的结果相吻合.

图 7(Fig. 7)

图 7 生物降解前后聚丙烯酰胺的傅里叶-红外光谱图 Fig. 7 FT-IR spectrum of HPAM before and after Biodegraded by the Mixed strains

为了对厌氧瓶生物降解实验进行扩大化研究，并加速反应器的启动，将最优条件下培养的混合菌接种到装有1/2体积污泥的ABR中，进行ABR厌氧生物降解实验.整个ABR实验在室温条件下进行，试验确立了ABR的水力停留时间为24 h，出水回流比为10 ∶ 1，用葡萄糖与HPAM作为共基质来调节COD_Cr，从而达到所需的容积负荷.

ABR的启动分为两个阶段：第一阶段，所配污水的COD_Cr控制在500 mg · L^-1，容积负荷为0.50 kg · m^-3 · d^-1(以COD_Cr计)，第一阶段运行25 d后，COD_Cr和HPAM的去除效果较为理想；随即进入启动的第二阶段，增加COD_Cr到1700 mg · L^-1，容积负荷增加到1.3 kg · m^-3 · d^-1.

反应器经过启动阶段55 d的运行，COD_Cr的去除率在75%以上，HPAM的去除率也在60%以上，这表明ABR反应器达到了稳定状态.此时，通入模拟污水20 d，每隔1 d测定COD_Cr和HPAM的浓度.图 8和图 9分别体现了COD_Cr和HPAM的变化.由图 8可以看出，尽管进水的COD_Cr不断变化，但COD_Cr的去除率都能达到85%以上.尤其当进水COD_Cr为1693 mg · L^-1时，出水COD_Cr能够降到170 mg · L^-1，此时，COD_Cr的去除率最高，达到89.96%.而在图 9中，第14 d时HPAM降解率最高，为75.48%，明显高于魏利和马放(2007)研究的61.2%的HPAM降解率，这说明ABR能有效地处理高浓度含HPAM污水.

图 8(Fig. 8)

图 8 CODCr的浓度和降解率随时间的变化 Fig. 8 CODCr concentrations and removal efficiencies variations over time

图 9(Fig. 9)

图 9 ABR中HPAM降解率随时间的变化 Fig. 9 HPAM Removal Efficiencies Variations over Time in ABR

ABR启动完成后，取出适量的污泥进行观察，发现有黑色厌氧颗粒污泥形成.用蒸馏水冲洗掉絮状污泥，挑取出厌氧颗粒污泥于培养皿中，分别对接种颗粒污泥和成熟颗粒污泥的外观形态进行SEM分析.从图 10a中可以看出，接种污泥的结构不紧密，呈零碎状态，很容易被进入反应器的污水冲走或者被水流剪切成碎片，成为新生厌氧颗粒污泥的内核，有利于重新组装成比较大的颗粒污泥.而与接种污泥相比，成熟后的厌氧污泥(图 10b)结构紧密，表面呈多孔结构.紧凑的结构增加了微生物与HPAM的接触面积，有利于提高HPAM的降解率，为增加生物量提供了可能.而多孔的结构能为微生物提供有机质，并且也是微生物的产气通道(李宗义等，2003).除此之外，成熟颗粒污泥表面有大量的微生物存在，其中以短杆菌和球菌为主，这也验证了成熟污泥有利于微生物的大量生长和繁殖.分析结果表明，ABR内形成了成熟的颗粒污泥，它们能有效地降解HPAM，并为菌株的生长繁殖提供有利的条件.

图 10(Fig. 10)

图 10 颗粒污泥的扫描电镜图片(a.接种污泥；b.成熟污泥) Fig. 10 Scanning electron microscopy images of granular sludge in ABR(a.Inoculated sludge；b.Mature sludge)

1)运用厌氧瓶对含500 mg · L^-1 HPAM的污水进行厌氧水解酸化生物处理，结果发现，当降解时间为9 d，连续活化次数为3次，温度为35~40 ℃，初始pH值为7.5时，混合菌的降解效果最好，降解率可达40.69%，说明厌氧水解酸化能够降解HPAM.生物降解前后HPAM的傅里叶-红外光谱图对比显示，细菌能够降解并利用HPAM的部分胺基和碳作为生长所需的氮源和碳源，并且推断HPAM的降解过程发生在水解酸化阶段.通过生理生化特征和16S rDNA分析，确定PAM-F1为红球菌.

2)经过ABR处理的含500 mg · L^-1 HPAM的污水，COD_Cr去除率和HPAM降解率最高分别可达89.96%和75.48%.颗粒污泥的扫描电镜观察显示，ABR内形成了成熟的颗粒污泥，它们能够有效地促进HPAM的生物降解，并为微生物的生长繁殖提供有利的条件.ABR实验进一步证明了厌氧水解酸化过程可以有效地处理含高浓度HPAM污水.