在地下水资源开发(蘭宗宗和田玉新，2010)、水源热泵(李卓等，2010)、中水微灌(薛英文等，2007)以及油田开采过程(李阳，2002)中，需要向地层中进行大量注水，不可避免会带入霉菌、酵母菌、放线菌等微生物(Wingender et al., 1999；Chong et al., 2008；Jarusutthirak et al., 2002).在适宜的条件下，这些微生物迅速繁殖，并分泌大量的胞外聚合物(Metzger et al., 2007；Zhang et al., 2007)(Extracellular Polymeric Substances，EPS).胞外聚合物是一类高分子粘性聚合物，通常附着在含水介质的颗粒表面，降低其有效孔隙度，从而形成生物堵塞.此外，生物堵塞现象还在膜生物反应器以及生物滤池中普遍存在.马立等(2005)在下向流生物滤池的进水端发现微生物种群丰富，菌胶团结构致密，胞外聚合物的积累加上悬浮物的截留，使得生物滤池水头损失增加较快，发生严重的生物堵塞.工程实践表明，由胞外聚合物积累导致的生物堵塞严重影响着工程的效率、维护成本以及设备的使用寿命(杜新强等，2009).

微生物分泌的胞外聚合物成分复杂，主要由多糖和蛋白质组成，其组成和含量受诸多因素影响(Sheng et al., 2010).Li和Yang(2007)研究了不同碳源对活性污泥产生EPS的影响，认为以葡萄糖为碳源时，污泥产生的EPS含量最高.Durmaz和Sanin(2001)研究了不同C∶N下活性污泥EPS组分的变化，发现随着C ∶ N升高，EPS中多糖含量增多，蛋白质含量降低.Jia等(1996)认为，在细菌对数生长期内，EPS浓度随培养时间逐渐升高；而在细菌处于生长稳定期时，EPS含量随培养时间反而下降.李久义等(2002)对曝气生物滤池中生物膜EPS进行研究，认为多糖是EPS最主要的组成部分，并且EPS含量随进水有机物浓度降低而逐渐下降.曹相生等(2004)研究了Mn²⁺、Mo⁶⁺和Zn²⁺对活性污泥中EPS组分的影响，认为低浓度(0.05 g · L^-1)Mn²⁺导致EPS中蛋白质、多糖和核酸含量下降，而Zn²⁺使EPS中多糖含量改变，进而导致蛋白质/多糖比值的改变，Mo⁶⁺则对EPS各组分基本没有影响.

在环境工程领域中，有关胞外聚合物的研究多是针对其对活性污泥疏水性、絮凝性、沉降性以及对重金属离子吸附性(罗曦等，2005)的影响，而对于胞外聚合物在含水介质中的积累作用报道较少.本文以粗砂为代表性含水介质，通过砂柱试验模拟人工回灌过程，考察回灌条件对粗砂介质上胞外聚合物组成和含量的影响，该研究可为含水层生物堵塞机理和防治等提供科学依据.

试验装置见图 1，砂柱由有机玻璃制成，高22 cm，内径5 cm.柱体一侧距底部进水口0、2、4、6、12、18 cm处分别设测压口.试验采用蠕动泵将回灌水以恒定流速由底部进水口泵入，流经砂柱后由出水口排出.

图 1(Fig. 1)

图 1 试验装置示意图 Fig. 1 Schematic diagram of experiment equipment

供试砂样取自青岛市大沽河下游潜水含水层，该砂样为粗砂，其粒径分布曲线见图 2，砂样基本物理性质见表 1.本文采用实验室配水的方法，将蒸馏水中分别加入葡萄糖、氯化铵(NH₄Cl)、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)作碳、氮和磷源，并加入微生物生长所需微量元素(孔祥平，2007).

图 2(Fig. 2)

图 2 供试砂样粒径分布曲线 Fig. 2 Particle size distribution curve of s and sample

表1(Table.1)

表1 砂样基本物理性质 Table.1 Physical properties of s and sample

表1 砂样基本物理性质 Table.1 Physical properties of s and sample 主要性质 有机质含量 天然含水率 容重/(g·cm-3) 比重 孔隙率 砂样 0.31% 7.87% 1.63 2.65 38.5%

菌种取自青岛市大沽河下游贾疃坝附近的堵塞含水层.利用异养菌平板计数法(杨海燕和朱万学，2005)测定供试微生物种群数量，分别采用牛肉膏蛋白胨培养基、厌氧富集培养基、高氏一号培养基及马丁氏培养基(周群英和王士芬，2008)培养好氧细菌、厌氧细菌、放线菌及真菌，并进行计数，每组试验做2个平行样.微生物数量、形态见表 2和图 3.

表2(Table.2)

表2 微生物种群数量 Table.2 Microorganism quantity on porous medium

表2 微生物种群数量 Table.2 Microorganism quantity on porous medium 微生物 好氧细菌/ (×106 CFU·g-1) 厌氧细菌/ (×104 CFU·g-1) 放线菌/ (×106 CFU·g-1) 真菌/ (×104 CFU·g-1) 数量 4.11 0.35 2.58 4.71

图 3(Fig. 3)

图 3 显微镜下附着微生物微观形态(a)和扫描电镜下附着微生物及EPS空间形态(b) Fig. 3 Gram′s stain of the attached microorganism on porous medium(a) and SEM image of the attached microorganism and EPS on porous medium(b)

由图 3可得，介质中的细菌主要以短杆菌为主；砂粒上的附着微生物在胞外聚合物的作用下相互粘结成团，形成黏性菌胶团附着在砂粒表面.菌体分泌的胞外聚合物可以降低介质的有效孔隙度，增加流体粘度，增强菌体细胞之间的粘附性，同时增加流体-介质之间的摩擦力，从而降低含水介质的渗透性.

通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对供试微生物的优势菌种进行鉴定，分别属于甲基杆菌属(Methylobacterium )、紫色杆菌属(Janthinobacterium)、耶尔森杆菌属(Yersinia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、食酸菌属(Acidovorax).查阅文献可知，供试菌种中的甲基杆菌属、紫色杆菌属、葡萄球菌属和食酸菌属均为产粘性胞外聚合物的菌群(Nakamura et al., 1976).

采用砂柱试验模拟人工回灌过程中含水层的生物堵塞，通过介质渗透系数的变化，描述不同砂柱的堵塞过程.试验开始前，用自来水对砂柱进行饱水，计算砂柱的初始渗透系数.待初始渗透系数稳定后进行人工回灌试验.其中，渗透系数由式(1)求得：

回灌试验结束后，利用公式(1)计算砂柱的渗透系数.其中，Q为出水流量，D=5 cm，Δx为砂柱上、下测压管的水头损失，Δh为两测压管距离(18 cm).以砂柱渗透系数的降低率描述砂柱的堵塞程度，公式如下：

菌种采集后，用曝气机充分曝气2 h.静置30 min，将上层清液以恒定流速(1 mL · min^-1)泵入饱水后的砂柱，接种6 h，关闭进、出水阀，保证含水介质上一定的菌种附着量.打开蠕动泵，以恒定流速(5 mL · min^-1)泵入营养液，模拟人工回灌过程.

回灌结束后，拆除砂柱，称取定量砂样，超声波振荡仪振荡数次(每次振荡时间不超过5 min，振荡的次数一般为1~3次，视振荡效果而定)，采用甲醛-氢氧化钠法提取微生物EPS(Frlund et al., 1996).为了保证多糖和蛋白质不变性，最好能在提取的当天测定.然后，采用苯酚-硫酸法(罗毅等，2005)和考马斯亮蓝法(李如亮，1998)分别测定EPS中多糖及蛋白质的含量，并将两者之和计为EPS总量，以单位质量砂样上附着含量表示(μg · g^-1).每组试验做2个平行样.

以回灌水碳、氮、磷浓度、盐度和温度为主要控制条件，进行砂柱回灌试验，分析各因素对微生物EPS中多糖、蛋白质含量的影响.

控制回灌水COD_Cr∶N∶P为100∶5∶1，使NaCl质量浓度为0.5%，选取葡萄糖作为微生物生长的唯一碳源.回灌试验进行216 h，计算不同砂柱渗透系数的降低率，并考察不同碳浓度下，EPS中多糖、蛋白质含量的变化(见图 4).

图 4(Fig. 4)

图 4 不同CODCr浓度下多糖和蛋白质组成和含量变化 Fig. 4 The polysaccharide and protein content under different concentrations of CODCr

由图 4可以看出，连续回灌216 h后，砂柱渗透系数均明显下降.同时，渗透系数的下降率与微生物EPS含量的变化趋势一致，说明砂柱的堵塞程度与EPS含量呈正相关性.COD_Cr为50 mg · L^-1时，EPS含量达到最大值(0.68 μg · g^-1)，此时砂柱渗透系数降低率为95%，堵塞程度最严重.随COD_Cr浓度的继续增加，EPS 略有降低，含水介质的渗透系数降低率从95%减小为78%，生物堵塞程度略有减轻.分析原因，当进水COD_Cr浓度很低时，微生物生长可利用的碳源远远低于正常生长所需的浓度，此时微生物将其用于维持生长，分泌的胞外聚合物含量很低，此时含水介质表面较为光滑，孔隙空间较大.随着COD_Cr 浓度的升高，微生物的生长不受碳源的限制，同时介质孔隙度较大，含氧量丰富，微生物生长速度加快，新陈代谢旺盛，分泌的EPS含量增多，堵塞相邻介质的连接通道.然而，随着EPS的大量积累，同时介质孔隙度降低，含氧量不足严重抑制微生物的正常生长，反而使EPS含量略有下降.

由图 4还可看出，微生物分泌的胞外聚合物中多糖明显高于蛋白质，占胞外聚合物的76%~95%，这与Flemming 等(Flemming and Wingender， 2001；Vocks et al., 2006；Susant et al., 2008；Yigit et al., 2008)的研究一致.此外，不同碳浓度下，多糖在微生物分泌的胞外聚合物总量中所占比例先降低后升高，说明碳源是影响EPS中多糖、蛋白质组成的主要因素.EPS中含有大量具有强吸附性的负电基团，例如蛋白质的酰胺(Ⅱ)、羧基以及多糖中的C—O—C、—OH等基团对进水中带正电的胶体具有络合能力.随着人工回灌的进行，EPS不断吸附进水中的胶体，减小了含水介质的有效孔隙度，从而降低其渗透性.

本试验中，控制回灌水COD_Cr、K₂HPO₄、NaCl浓度分别为50 mg · L^-1、0.5 mg · L^-1(以P计)、0.5%.选取NH₄Cl作为氮源.连续回灌216 h，计算砂柱渗透系数的降低率，考察不同NH₄Cl浓度下，EPS中多糖和蛋白质含量的变化，试验结果见图 5.

图 5(Fig. 5)

图 5 不同氮浓度下多糖和蛋白质组成和含量变化 Fig. 5 The polysaccharide and protein content under different concentrations of N

由图 5可以看出，连续回灌216 h后，砂柱的渗透系数均明显下降，说明粗砂介质上发生生物堵塞现象.回灌水NH₄Cl浓度很低时(0 mg · L^-1)，胞外聚合物的成分主要为多糖类，此时粗砂介质渗透系数下降率为35%.随进水NH₄Cl浓度的升高，粘附于介质表面的EPS含量呈现缓慢上升趋势，变化不大.此时砂柱渗透系数下降率从63%升至78%，介质堵塞程度略有加剧.分析原因，当进水氮浓度很低时，微生物不能进行正常的新陈代谢，只能将碳源转化为多糖类聚合物.随回灌水氮浓度的升高(0 mg · L^-1升至1.25 mg · L^-1)，氮源不再是限制微生物生长的因素，其生长速率加快，代谢能力增强，分泌胞外聚合物的量逐渐增多.EPS粘附于含水介质表面，堵塞介质孔隙通道，导致介质间有效孔隙减小，砂柱渗透系数急速下降(下降率为63%).随进水氮浓度继续升高(1.25 mg · L^-1升至5 mg · L^-1)，EPS大量附着于粗砂介质表面，致使孔隙含氧量降低，抑制微生物活动，其分泌的胞外聚合物的量呈现缓慢上升趋势，但基本变化不大.砂柱堵塞程度变化缓慢，渗透系数下降率从63%升至78%.由图 4还可以看出，不同氮浓度下，多糖在微生物分泌的胞外聚合物总量中所占比例变化不大，说明氮对EPS中多糖、蛋白质组成的影响不大.

控制进水COD_Cr、NH₄Cl、NaCl浓度分别为50 mg · L^-1、5 mg · L^-1(以N计)和0.5%.选取K₂HPO₄作为磷源.进行216 h人工回灌试验，计算砂柱渗透系数的降低率，考察不同磷浓度下，含水介质EPS中多糖和蛋白质组成和含量的变化(见图 6).

图 6(Fig. 6)

图 6 不同磷浓度下多糖和蛋白质组成和含量变化 Fig. 6 The polysaccharide and protein content under different concentrations of P

由图 6可以看出，当进水磷为0 mg · L^-1时，砂样上附着的EPS含量很低，仅为0.72 μg · g^-1，回灌结束时，砂柱渗透系数降低率为32%；随磷浓度的增大(0.5 mg · L^-1增大到1 mg · L^-1)，EPS含量呈现急速上升趋势，由0.83 μg · g^-1上升至2.03 μg · g^-1，砂柱渗透系数降低率从37%增大到70%.面对低磷环境时，微生物存在自身磷酸盐代谢体系(Zhao et al., 2005；Su et al., 2010；Ciston et al., 2009).当进水磷浓度很低时，微生物仍然会表现出一定的代谢能力.但此时磷源为微生物生长的限制因素，微生物生长繁殖能力较弱，仅产生少量的胞外聚合物，附着于含水介质的表面，对介质孔隙通道的堵塞效应较低，随回灌时间的延长，砂柱渗透系数下降较缓慢；随回灌水磷浓度的升高，微生物活性增强，并且含水介质间存在较大的孔隙空间，为其生长提供了必要的氧气.微生物通过自身代谢作用分泌的胞外聚合物，粘附于砂粒表面，增加了介质与流体之间的摩擦力.同时EPS吸附了大量胶体颗粒，导致其分泌量持续增多.EPS大量附着于粗砂介质表面，严重堵塞孔隙通道，致使渗透系数下降率达70%.由图 6还可以看出，在不同磷浓度下，多糖在微生物分泌的胞外聚合物总量中所占比例变化不大，说明磷并不是影响EPS中多糖、蛋白质组成的主要因素.

使进水COD_Cr、NH₄Cl、K₂HPO₄浓度分别为50 mg · L^-1、5 mg · L^-1(以N计)、1 mg · L^-1(以P计)，砂柱模拟人工回灌试验，计算砂柱渗透系数的降低率，分析盐浓度对微生物EPS中多糖和蛋白质组成和含量的影响(见图 7).

图 7(Fig. 7)

图 7 不同盐度下多糖和蛋白质组成和含量变化 Fig. 7 The polysaccharide and protein content under different concentrations of salt

由图 7可得，随进水NaCl浓度的升高，微生物EPS含量呈现先升高、后降低的趋势.砂柱渗透系数降低率亦呈现相同趋势.当进水NaCl浓度从0.01%升高至0.5%时，含水介质上的EPS附着量从1.85 μg · g^-1增加到3.22 μg · g^-1；渗透系数降低率从67%增大到89%.表明随EPS含量的增大，砂柱生物堵塞程度增强.当NaCl浓度继续增大时，EPS含量急剧下降，最低降至0.62 μg · g^-1；砂柱渗透系数降低率逐渐减小.分析原因，当进水盐浓度从0.01%增至0.5%时，盐度不再是限制微生物生长的主要因素，其生长迅速，新陈代谢旺盛，分泌了大量的EPS，粘附于砂粒表面.同时，离子浓度的升高导致含水介质中粘粒双电层的距离减小，降低其排斥力，使胞外聚合物与含水介质的结合力增强，致使砂柱渗透系数显著降低，降低率从67%增大至89%.而当NaCl浓度超过1%时，微生物无法适应外部高盐环境，在生长初期，发生细胞失水，进而死亡；只有少部分菌体发生细胞自溶现象，释放胞内聚合物，其中的负电性基团与含水介质中的胶体紧密吸附在一起，形成EPS，砂柱的堵塞程度有所缓解，降低率从41%降至30%.由图 7还可以看出，在不同盐度下，胞外聚合物中多糖所占比例先降低、后升高，说明盐度是影响EPS中多糖、蛋白质组成的因素之一.

控制回灌水COD_Cr、NH₄Cl、K₂HPO₄、NaCl浓度分别为50 mg · L^-1、5 mg · L^-1(以N计)、1 mg · L^-1(以P计)、0.5%.人工回灌216 h，计算砂柱渗透系数降低率，考察温度对含水介质EPS中多糖、蛋白质组成及含量的影响(见图 8).

图 8(Fig. 8)

图 8 不同温度下多糖和蛋白质组成和含量变化 Fig. 8 The polysaccharide and protein content under different temperature

由图 8可知，随回灌水温度的升高，微生物分泌的EPS含量呈现上升趋势，同时砂柱生物堵塞程度加剧.从15 ℃升高到30 ℃时，胞外聚合物从0.11 μg · g^-1增加至0.61 μg · g^-1，介质的渗透系数从35%增大至87%.分析原因，当环境温度很低时，微生物生长速率缓慢，新陈代谢能力较弱.随着温度的升高，微生物生长速率增大，新陈代谢旺盛，向周围环境分泌大量的代谢产物.此外，随回灌水温度的升高，含水介质粘粒间扩散双电层增大，表面电势随着双电层厚度增大而升高，粘粒之间以及粘粒与孔隙表面间的排斥力逐渐增大，导致粘粒释放.释放的粘粒随着回灌水的迁移被吸附于胞外聚合物的表面，导致含水介质的孔隙通道发生堵塞、中断，从而其渗透性降低.由图 8还可看出，不同温度下，多糖在微生物分泌的胞外聚合物中所占比例变化不大，说明温度对EPS中多糖、蛋白质组成的影响不大.

1)在研究的回灌条件下，含水介质中胞外聚合物的主要成分为多糖和蛋白质，其中多糖占总量的72%~99%.

2)砂柱生物堵塞程度与介质上附着的EPS含量呈正相关性.当回灌水碳、氮、磷浓度、盐度和温度分别为50 mg · L^-1、5 mg · L^-1、1 mg · L^-1、0.5%和30 ℃时，最有利于微生物分泌胞外聚合物，产生量最大，砂柱渗透系数降低率最大，堵塞程度最严重.碳、磷浓度、盐度和温度是影响胞外聚合物生成的主要因素，而氮对EPS的生成量影响不大.

3)水中碳浓度和盐度对微生物胞外聚合物中多糖、蛋白质的组成影响较大，而氮、磷浓度和温度是相对次要的因素.