甲醛(Formaldehyde，FA)是我国城市室内空气的主要污染物，主要来源于装修材料、工业、医疗、服装及化妆品行业.2004年，国际癌症研究中心(IARC)的工作小组发布了甲醛致癌影响的评估研究报告，将其确定为第1A类物质(人类致癌物)(张晓勇等，2006；张瑾，2006；Tang et al., 2009；Luo et al., 2012).目前，有关甲醛与白血病的相关研究是学术界的一个热点，而对于两者关系的论证研究主要集中于流行病学上，在分子毒理学方面的研究还不够充分(d′A Heck et al., 2004)，且无法直接证据证明甲醛可运输到骨髓造血组织，诱发白血病(Zhang et al., 2009;Golden et al., 2006; Just et al., 2011).

在白血病致病的机理研究中，研究发现，白血病的发生是由于生物的基因出了问题，如癌基因N-ras的激活、抑癌基因P16的缺失与突变、抑癌基因P73的失活及调控基因核心结合因子的突变都可能导致白血病的发生(何重香等，2009;袁芳等，2009;葛秀国等，2003).白血病是造血系统的恶性疾病，与造血干细胞密切相关.在造血干细胞的增殖和分化、髓系和淋巴系细胞等的成熟过程中，众多转录因子在血细胞生成过程的调控作用中既相互作用又表现出各自的特异性(朱守伟等，2010).部分转录因子在造血调控中的作用位置如图 1所示.血细胞生成是一个极其复杂的过程，转录因子在这个过程中起到了重要的调控作用.因此，本实验选取部分髓系转录因子C/EBPα，红系和巨核系转录因子：SCL、GATA-2、c-myb、NFE2和GATA-1，以及淋巴系转录因子Ikzf5、PAX5作为研究对象，分为两条线路来分析甲醛在由自我更新的干细胞增殖到分化为多功能造血干细胞，最后到巨核细胞和T细胞过程中的影响，以及对淋巴样祖细胞和髓样祖细胞的分裂分化过程的影响.以期通过甲醛暴露研究甲醛能否影响小鼠造血调控转录因子等基因的表达稳定性，从而为揭示甲醛对造血细胞的毒性分子机制提供证据.

图 1(Fig. 1)

图 1 转录因子在造血调控中的作用位置 Fig. 1 The role of transcription factors in hematopoietic regulation

实验动物：SPF级雄性Balb/C小鼠，6周龄，体重18~22 g，由湖北省疾病预防控制中心实验动物饲养所提供(动物合格证号：SCXK(鄂)2008—0005；动物质量合格证：4200695884).

主要仪器：HOPE-MED8050动式染毒控制系统，低温冷冻离心机(德国EPPENDORF公司)，DYY-11B型三恒电泳仪及DYY-III型电泳仪，PCR仪(BIORAD)，凝胶成像系统(Genus Inc)，细胞分析仪等.

主要试剂：反转录酶及其Buffer、RNA酶抑制剂、Oligo dT、dNTP mixture、聚合酶均购自Takara公司，引物由南京金斯瑞有限公司合成.

实验采用的染毒装置是HOPE-MED8050动式染毒控制系统，本实验中，温度控制为(23.0±0.5)℃，湿度控制为45%，进气速度为1.6 m³ · h^-1；将18只小鼠分为3组，分别为空白组和甲醛染毒组(0.5 mg · m^-3和3.0 mg · m^-3)，每组6只，每天染毒8 h，持续时间为2周.染毒结束后，取小鼠静脉外周血0.02 mL，加肝素(100 U · mL^-1)抗凝，用血细胞分析仪进行白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白含量测定和血小板计数.

骨髓组织总RNA的提取：小鼠脱颈处死，用PBS吹出小鼠股骨骨髓组织细胞，离心(500 g)5 min，弃上清，加入1 mL trizol，室温放置15 min；然后根据制造商的提示步骤用trizol提取总RNA.

采用凝胶电泳检验RNA的纯度.RT-PCR检测mRNA表达水平，目的是将提取的总RNA反转录为cDNA.实验采用两步法，总体积为20 μL，通过PCR将cDNA进行扩增.利用Primer 5.0软件设计引物，序列如表 1.

表1(Table 1)

表1 引物序列、长度及退火温度 Table 1 Primer sequences，length and annealing temperature

表1 引物序列、长度及退火温度 Table 1 Primer sequences，length and annealing temperature 基因 引物序列(5′ to 3′) 产物长度/bp 退火温度/℃ β-actin2 上游引物GCTGTCCCTGTATGCCTCT 461 58 下游引物GGTCTTTACGGATGTCAACG     GATA-1 上游引物GATGGAATCCAGACGAGGAA 264 62 下游引物ACAGGCCCTGACAGTACCAC     GATA-2 上游引物TGGGCTCTACCACAAGATGA 329 56.7 下游引物TGGAGAGCTCCTCGAAACAT     C/EBPα 上游引物TTACAACAGGCCAGGTTTCC 232 57 下游引物CTCTGGGATGGATCGATTGT     SCL 上游引物GGCAGACAGAGACTGATCCTG 163 57.3 下游引物AATGGGAAAGAACCAGCCTTA     c-myb 上游引物GGACAGCAGGCATTACCAA 119 53 下游引物TCTCCCAAACAGGAAACAG     NFE-2 上游引物TCAGCTGGCACAGTAGGATG 299 63 下游引物TTCTGGGACATGGGGAGTAG     Ikzf5 上游引物CCAATGTGCTCATGGTTCAC 367 59 下游引物TCTTCTGCCATCTCGTTGTG     PAX5 上游引物AACTTGCCCATCAAGGTGTC 112 65.5 下游引物GGCTTGATGCTTCCTGTCTC

选择β-actin2作为内参对照，将上述反转录所得的cDNA进行目的基因扩增，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，加Rnase-Free Water 至20 μL.PCR循环体系如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，94 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；终止，72 ℃延伸10 min； 4 ℃永久保存；反应完成后，将产物于-20 ℃保存待用.

琼脂糖凝胶电泳：电泳缓冲液是0.5倍的TBE缓冲液，选用2%的琼脂糖胶，点样体积为5 μL，电压为85 V，时间为50 min.电泳完毕后将凝胶放入已稀释好的EB溶液中浸泡染色20 min，取出后进行照胶.采用Origin6.1统计分析软件对实验数据进行统计分析.

对小鼠外周血血象进行分析，结果如图 2所示.从图 2可以看出，与对照组相比，经甲醛染毒的小鼠血液中白细胞、红细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞的数量都有不同程度的减少或增加.具体而言，经甲醛染毒后，与对照组相比，甲醛浓度为0.5 mg · m^-3和3.0 mg · m^-3的染毒组小鼠血液中白细胞和红细胞总数都减少，差异都具有统计学意义，且在甲醛浓度为3.0 mg · m^-3时差异性更显著；染毒组小鼠血液中淋巴细胞数量均下降，且差异具有统计学意义；染毒组小鼠血液中单核细胞数量均下降，并且在甲醛浓度为0.5 mg · m^-3时差异具有统计学意义；染毒组小鼠血液中中性粒细胞数量的变化不是特别明显；染毒组小鼠血液中血小板数量都增加，差异都具有统计学意义，且在甲醛浓度为0.5 mg · m^-3时，差异性更显著. 因此，小鼠的血象分析结果可以说明甲醛确实对小鼠的血细胞、淋巴细胞等具有某种程度的影响.

图 2(Fig. 2)

图 2 小鼠外周血象分析结果(*p<0.05，**p<0.01，与空白组相比，样品数N=6) Fig. 2 Mice peripheral blood analysis results

C/EBPα属于C/EBP转录因子家族.C/EBP家族C端35个氨基酸残基形成α螺旋，每隔6个氨基酸有一个亮氨酸，这些亮氨酸在螺旋的同侧出现，是二聚体形成的基础.C/EBPα倾向于在髓系中表达.在调节骨髓造血的过程中，C/EBPα通过调控细胞因子及其受体、其他转录因子及细胞系特异性基因的表达来发挥作用.在造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSC)的分化过程中，C/EBPα通过抑制红细胞的分化和诱导髓细胞的分化从而决定了多能祖细胞的分化方向(朱守伟等，2010).经甲醛染毒后，其mRNA表达量如图 3所示.从实验结果中可以得出，经甲醛染毒后，与对照组相比，甲醛浓度为3.0 mg · m^-3的染毒组小鼠骨髓组织中C/EBPα在mRNA水平表达量下降，差异具有统计学意义；且随着甲醛浓度的升高，其表达量呈下降趋势.说明甲醛对转录因子C/EBPα具有某种程度的影响.

图 3(Fig. 3)

图 3 小鼠骨髓组织C/EBPα基因的RT-PCR电泳图及mRNA表达量的变化图(*p<0.05，* *p<0.01与(空白组相比)，样品数N=6，β-actin为内参对照，下同) Fig. 3 RT-PCR electrophoregram and histogram of transcription at mRNA level of C/EBPα gene in mice bone marrow

调控红系早期分化转录因子(SCL)是bHLH家族成员之一，SCL控制着造血干细胞的分化和各系的成熟过程，参与造血干细胞向髓系祖细胞分化的调控，SCL的表达减少可引起髓系和红系祖细胞的分化障碍.SCL在红细胞和巨核细胞的成熟中具有重要作用.SCL的DNA结合异常可阻碍红细胞和巨核细胞的成熟(朱守伟等，2010).经甲醛染毒后，其mRNA表达量如图 4所示.从实验结果中可以看出，经甲醛染毒后，与对照组相比，甲醛浓度为0.5 mg · m^-3和3.0 mg · m^-3 的染毒组小鼠骨髓组织中mRNA表达量均下降，且随着甲醛浓度的升高，其表达量呈下降趋势，但差异不具有统计学意义.

图 4(Fig. 4)

图 4 小鼠骨髓组织SCL基因的RT-PCR电泳图及mRNA表达量的变化图 Fig. 4 RT-PCR electrophoregram and histogram of transcription at mRNA level of SCL gene in mice bone marrow

调控红系祖细胞增殖的转录因子包括GATA-2和c-myb，其中，GATA-2属于锌指结构家族的成员，两个锌指结构功能不同，C末端锌指状结构主要是结合DNA 序列，N末端锌指状结构则是协同、增强结合的稳固性和特异性，但GATA-2的N末端具有独立结合特异性DNA 序列的能力，这一特性有助于区别GATA-2 与其他GATA 转录因子.GATA-2 在造血干/祖细胞的增殖和分化中起着重要的作用，GATA-2基因的缺失可导致造血功能的严重缺陷和胚胎死亡.GATA-2在未成熟的造血细胞中高度表达，并随着造血细胞的分化、发育成熟表达下调(廖维维等，2007;史莹华等，2005). c-cmy蛋白是原癌基因c-myb基因的编码产物，由637个氨基酸组成，具有高度保守的DNA结合域，C端与DNA结合域之间具有一个转录激活功能域，其还存在一负性调节域.c-myb是一种与细胞增殖、分化相关的核转录因子.研究表明，在c-myb基因敲除鼠中，造血干细胞数目明显减少.c-myb基因表达的下调促进了造血干细胞的分化(范晨等，2011). 经甲醛染毒后，两转录因子mRNA的表达量如图 5和图 6所示.

图 5(Fig. 5)

图 5 小鼠骨髓组织GATA-2基因的RT-PCR电泳图及mRNA表达量的变化图 Fig. 5 RT-PCR electrophoregram and histogram of transcription at mRNA level of GATA-2 gene in mice bone marrow

图 6(Fig. 6)

图 6 小鼠骨髓组织c-myb基因的RT-PCR电泳图及mRNA表达量的变化图 Fig. 6 RT-PCR electrophoregram and histogram of transcription at mRNA level of c-myb gene in mice bone marrow

从实验结果中可以看出，对于转录因子GATA-2，与对照组相比，甲醛浓度为3.0 mg · m^-3的染毒组小鼠骨髓组织中mRNA表达量下降，差异具有统计学意义；对于转录因子c-myb，与对照组相比，甲醛浓度为3.0 mg · m^-3的染毒组小鼠骨髓组织中mRNA表达量升高，差异具有统计学意义.

调控红系终末分化的转录因子包括GATA-1和NFE-2.其中，GATA-1属于锌指结构转录因子，其DNA结合区包含两个高度保守的锌指结构，处于C端的一个锌指对与DNA的特异结合是必需和充分的，N端的锌指结构对DNA结合起稳定作用.GATA-1和它的辅助因子FOG-1(Friend of GATA-1)在红细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和巨核细胞的发育中都具有重要的作用(Crispino，2005;吴秀丽等，2002;刘咏梅等，2006).

NFE2转录因子是CNC家族成员之一，在细胞氧化应激反应引发的细胞适应性变化过程中发挥重要作用.在红系分化和珠蛋白基因表达调控中起重要作用，主要是调控巨核细胞的生成(徐冬冬等，2000;李煌元等，2006).经甲醛染毒后，两转录因子mRNA的表达量如图 7和图 8所示.

图 7(Fig. 7)

图 7 小鼠骨髓组织GATA-1基因RT-PCR电泳图及mRNA表达量的变化图 Fig. 7 RT-PCR electrophoregram and histogram of transcription at mRNA level of GATA-1 gene in mice bone marrow

图 8(Fig. 8)

图 8 小鼠骨髓组织NFE2基因的RT-PCR电泳图及mRNA表达量的变化图 Fig. 8 RT-PCR electrophoregram and histogram of transcription at mRNA level of NEF2 gene in mice bone marrow

从实验结果中可以看出，对于转录因子GATA-1，与对照组相比，甲醛浓度为3.0 mg · m^-3的染毒组小鼠骨髓组织中mRNA表达量升高，差异具有统计学意义；对于转录因子NFE-2，与对照组相比，甲醛浓度为0.5 mg · m^-3和3.0 mg · m^-3的染毒组小鼠骨髓组织中mRNA表达量均下降，并且差异都具有统计学意义.

Ikzf5属于Ikaros家族，具有Ikaros家族的共同结构特征：氨基酸序列两端有特征锌指蛋白结构域，C端的两个锌指结构介导Ikaros家族蛋白的自身联系，N端的锌指结构具有DNA结合活性.Ikaros对于造血系统和免疫调节具有重要的作用，且其功能相当保守，是淋巴细胞发育过程中不可缺少的转录因子(李风玲等，2011). PAX5是PAX家族中的一员，PAX家族以PD(Paired domain)为特征，含有128个氨基酸的DNA结合结构域.PAX5蛋白含有HLH基序，可与bHLH蛋白形成异二聚体，阻止其与DNA结合.PAX5在B淋巴细胞分化中具有重要作用(朱守伟等，2010). 经甲醛染毒，转录因子mRNA表达量如图 9和图 10所示.

图 9(Fig. 9)

图 9 小鼠骨髓组织Ikzf5基因的RT-PCR电泳图及mRNA表达量的变化图 Fig. 9 RT-PCR electrophoregram and histogram of transcription at mRNA level of Ikzf5 gene in mice bone marrow

图 10(Fig. 10)

图 10 小鼠骨髓组织PAX5基因的RT-PCR电泳图及mRNA表达量的变化图 Fig. 10 RT-PCR electrophoregram and histogram of transcription at mRNA level of PAX5 gene in mice bone marrow

从实验结果中可以看出，对于转录因子Ikzf5和PAX5，与对照组相比，甲醛浓度为0.5 mg · m^-3和3.0 mg · m^-3的染毒组小鼠淋巴组织中mRNA表达量均升高，且随着甲醛浓度的升高，其表达量呈上升趋势.转录因子Ikzf5 mRNA的表达量差异在甲醛浓度为0.5 mg · m^-3和3.0 mg · m^-3时都有统计学意义，且在浓度为3.0 mg · m^-3时差异更显著；转录因子PAX5 mRNA表达量差异在甲醛浓度为3.0 mg · m^-3时具有统计学意义.

从实验结果中可以看出，甲醛暴露确实对小鼠造血干细胞的分化产生影响，使得小鼠血液中血细胞和相关的淋巴细胞的数目异常，其中，白细胞、红细胞、淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞的数目均降低，血小板数目增加，且与对照组相比，除中性粒细胞外其他细胞数目均有显著性差异.从甲醛对本次研究所选取的重要转录因子的影响中可以初步判定，甲醛对造血干细胞分化的影响是通过影响相关转录因子的表达而起作用的，甲醛导致骨髓组织和淋巴组织中相关转录因子的表达异常，从而使甲醛暴露影响骨骼和淋巴的正常表达，增加白血病的患病风险，但其具体的作用机制如相关转录因子表达量的增减是否具有关联性目前尚不清楚，还需更多的分子生物学证据及进一步的研究.