合成染料根据其结构可分为偶氮类、蒽醌类、杂环类、酞菁类等，应用于纺织印染、造纸、皮革、化妆品、制药等行业(Daassi et al., 2012).在印染行业使用的染料就超过1000种，全球每年的染料使用量估计高达800000 t，其中的10%~15%在染色过程中随着废水排出；许多染料有致突、致癌毒性，而且结构复杂，市政污水系统的好氧处理难以对印染废水进行脱色；吸附、絮凝、离子交换、超滤、电化学、化学氧化、光催化氧化等物理化学方法可以对印染废水进行脱色，但成本较高.近年来微生物酶法脱色作为一种环境友好技术受到广泛关注(卢开聪，2005；Murugesan et al., 2007a; Manavalan et al., 2013).

漆酶是一种含有铜离子的多酚氧化酶，它能催化多酚、木质素、氨基苯酚、多胺、芳基二胺等多种芳香族、非芳香族化合物发生氧化反应(Couto and Toca-Herrera， 2007).它催化的特点就是使氧分子还原成为水，同时底物所形成的自由基可以自身结合或者相互偶联，形成聚合物或偶联物，而不产生其他物质(刘涛等，2005)，因此漆酶的优点在于其催化染料脱色时不产生新的有害产物，是一种环保用酶.能够产生漆酶的物种有很多，包括动物、植物、细菌、真菌等，其中利用白腐真菌生产漆酶被认为最具前景，Ganoderma lucidum分泌的漆酶具有耐热性好、最适pH偏酸、脱色效率高等特点(司静等，2011; Murugesan et al., 2007a).

纺织印染废水中成分复杂，含有多种染料、纺织助剂、盐类、表面活性剂、纺织品降解物等(卢开聪，2005；Khlifi et al., 2010; Kim et al., 2012)，而目前漆酶脱色研究主要集中于对单种染料的降解(Murugesan et al., 2007b; Kim et al., 2012).酸性黑ATT(图 1)属于一种复合的偶氮染料，由酸性黑10B和酸性橙Ⅱ按照70 ∶ 30比例调合而成，常用于毛、丝、棉纶及其混纺织物的染色，是一种代表性的复合染料(化学工业部染料工业科技情报中心站，1995).本研究利用Ganoderma lucidum wz-32所产漆酶催化酸性黑ATT脱色的条件，同时考虑到漆酶的催化作用会受到金属离子、酶抑制剂和催化助剂的影响，研究了一些金属离子和化学试剂对脱色的影响，以期为漆酶在复合染料废水脱色处理领域的深入研究及工业化应用提供基础.

图 1(Fig. 1)

图 1 酸性黑ATT染料组成及分子结构 Fig. 1 Component and chemical structure of Acid Black ATT

酸性黑ATT(Acid Black ATT)，购自温州市化工市场.

ABTS(2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)、HBT(1-羟基-苯并-三氮唑)，购自Sigma公司；磷酸氢二钠、柠檬酸、硫酸铜、氯化钴、硫酸钠、硫酸亚铁、氯化锰、碘化钾、EDTA-钠(乙二胺四乙酸二钠)、SDS(十二烷基硫酸钠)等试剂均为市售分析纯.

将白腐菌Ganoderma lucidum wz-32(温州大学发酵工程实验室保存)接种于150 mL种子培养基(葡萄糖2%，玉米粉2%，豆粕2%，硫酸镁0.075%，磷酸氢二钾0.15%，水)在28 ℃、165 r · min^-1摇床培养7d.将种子液按10%的接种量接种于发酵罐中，28 ℃液体发酵培养5d(培养基:可溶性淀粉2%，花生壳3%，豆粕1.5%，硫酸镁0.075%，磷酸氢二钾0.15%，硫酸铜0.01%，水).发酵结束后5000 r · min^-1离心条件下取上清液即为粗酶液，置于4 ℃冰箱保存备用.

反应总体系3 mL，含0.1 mL经稀释的酶液，1.9 mL pH 3.0的缓冲液(柠檬酸-磷酸氢二钠)和1.0 mL 0.5 mmol · L^-1 ABTS溶液.50 ℃水浴保温3 min，420 nm处测定吸光值.每min氧化1 μmol底物(ABTS，吸光系数为36000 L ·(mol · cm)^-1)所需要的酶量为1个酶活单位(U)(林俊芳等，2009).

用蒸馏水把酸性黑ATT配成0.1 g · L^-1的母液，测定时将溶液稀释到线性范围内，以蒸馏水为参比，进行光谱扫描得到酸性黑ATT的最大吸收波长为636.00nm.

在20mL的反应体系中，用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调整脱色体系的pH，控制变量法依次改变脱色pH、时间、温度、酶活、染料浓度进行试验.分别测定脱色前后的吸光值(A)，脱色率的计算公式(Khlifi et al., 2010):

为确定漆酶催化酸性黑ATT脱色的最佳条件，对加酶量、pH、温度、染料浓度进行正交优化试验，选用L₉(3⁴)正交表安排试验，各因素的试验水平根据单因素的试验结果确定，具体见表 1.

表1(Table 1)

表1 正交试验设计因素水平表 Table 1 Orthogonal experiment design

表1 正交试验设计因素水平表 Table 1 Orthogonal experiment design 水平 加酶量(A)/ (U·mL-1) pH(B) 温度(C)/ ℃ 染料浓度(D)/ (g·L-1) 1 3 4 40 0.100 2 6 5 50 0.125 3 9 6 60 0.150

在pH 5.0、加酶量6 U · mL^-1、温度为60 ℃、染料浓度0.1 g · L^-1时，分别在保温5、10、20、30、40、50、60、70、80 min时取样，测定脱色率.结果(图 2)表明随着时间的延长，染料溶液的脱色率变化先快后慢，在反应的前20 min，其脱色率变化是最快的，20 min后其脱色率变化越来越小，60 min以后脱色率变化不大.随着时间的延长，酶与染料中的成分已经充分接触并使之脱色，60 min后体系中的染料浓度较低，不利于与酶活性中心结合，所以确定脱色时间为60 min进行后续试验.

图 2(Fig. 2)

图 2 漆酶催化酸性黑ATT脱色随时间的变化 Fig. 2 Time-course of decolorization of Acid Black ATT catalyzed by laccase

在加酶量6 U · mL^-1、温度60 ℃、染料浓度0.1 g · L^-1条件下，分别调节缓冲液pH为3、4、5、6、7、8，保温60 min.研究pH对漆酶催化酸性黑ATT脱色的影响，结果(图 3)表明，当pH为3~8时，随着pH的增大，脱色率呈先上升后下降的趋势，pH为5时脱色效果最好.pH是影响酶活的主要因素之一，对酶活的影响关系到酶作用于染液的效果，而漆酶的酶活在偏酸的环境中较高(赵世光等，2013)，在酸性条件下有利于漆酶催化酸性黑ATT脱色.G.lucidum所产漆酶适应的pH范围较宽，在pH 4.0~7.5酶活稳定(Manavalan et al., 2013)，pH 4.0对偶氮染料Remazol Black-5和蒽醌染料Remazol Brilliant Blue R的脱色效果最好(Murugesan et al., 2007a).

图 3(Fig. 3)

图 3 pH对漆酶催化酸性黑ATT脱色的影响 Fig. 3 Effects of pH on decolorization of Acid Black ATT catalyzed by laccase

在pH 5.0、加酶量6 U · mL^-1、染料浓度0.1 g · L^-1条件下，分别设定温度为40、50、60、70 ℃，保温60 min.研究温度对漆酶催化酸性黑ATT脱色的影响，结果(图 4)表明，在40~60 ℃范围内，脱色率变化不大，脱色率最高可达81%.G. lucidum所产漆酶为耐热性酶，在60 ℃时的半衰期为2 h，4 h后残存酶活为25%，但70 ℃时酶活快速下降(Murugesan et al., 2007a)，本研究结果与之相一致，当温度为70 ℃时，脱色率明显减小，因为温度过高会导致酶蛋白变性，使酶的活性大幅下降，导致脱色率降低.

图 4(Fig. 4)

图 4 温度对漆酶催化酸性黑ATT脱色的影响 Fig. 4 Effects of temperature on decolorization of Acid Black ATT catalyzed by laccase

在pH 5.0、温度60 ℃、染料浓度0.1 g · L^-1条件下，分别加入3~30 U · mL^-1酶量，保温60 min，研究加酶量对漆酶催化酸性黑ATT脱色的影响.结果如图 5所示，在小于6 U · mL^-1的酶活范围内，随着加酶量的增加，脱色率与加酶量成正相关，随着酶的增多，反应活性中心增多，有利于与底物的结合从而提高脱色的效率(杨波等，2012)，加酶量在6 U · mL^-1时脱色率为84.62%，但继续增加酶量并不能进一步显著提高脱色率，这一结果与Murugesan等的结果相一致(Murugesan et al., 2007a).

图 5(Fig. 5)

图 5 加酶量对酸性黑ATT脱色的影响 Fig. 5 Effects of enzyme concentration on decolorization of Acid Black ATT

在pH 5.0、加酶量6 U · mL^-1、温度60 ℃条件下，分别添加浓度为0.05、0.10、0.15 g · L^-1、0.20、0.25、0.30 g · L^-1的酸性黑ATT染料，保温60 min，比较一定量的酶液脱色的染料浓度限度.如图 6所示，在染料浓度为0.05～0.30 g · L^-1时，脱色效果呈下降趋势，但脱色率相差不大，都在80%以上，表明G. lucidum wz-32所产漆酶能耐受较高浓度的酸性黑ATT染料.提高染料浓度在前期脱色率较低，但随着反应时间的延长，脱色率会逐渐上升，偶氮染料Remazol Black-5和蒽醌染料Remazol Brilliant Blue R在0.3 g · L^-1浓度下对漆酶没有抑制作用(Murugesan et al., 2007a).酸性黑ATT中含有磺酸基(—SO₃)，磺酸基对染料的生物降解有一定的抑制作用(戴珅等，2009).

图 6(Fig. 6)

图 6 染料浓度对酸性黑ATT脱色的影响 Fig. 6 Effects of dye concentration on decolorization of Acid Black ATT

对加酶量、pH、温度、染料浓度4个因子进行正交试验优化，结果(表 2)表明，对脱色率影响大小依次为C>B>D>A，即温度>pH值>染料浓度>加酶量，最优组合为A3B2C2D1，所对应的最佳条件为：加酶量9 U · mL^-1、反应pH 5.0、温度为50 ℃、染料浓度为0.1 g · L^-1.在此条件下进行验证性试验得到的脱色率为87.35%.

表2(Table 2)

表2 酸性黑ATT脱色的正交实验结果 Table 2 Result of orthogonal experiment on decolorization of Acid Black ATT

表2 酸性黑ATT脱色的正交实验结果 Table 2 Result of orthogonal experiment on decolorization of Acid Black ATT 试验号 因素水平 指标 脱色率 A 加酶量 B pH C 温度 D 染料浓度 1 1 1 1 1 79.31% 2 1 2 2 2 85.03% 3 1 3 3 3 64.89% 4 2 1 2 3 80.65% 5 2 2 3 1 73.57% 6 2 3 1 2 76.29% 7 3 1 3 2 71.57% 8 3 2 1 3 78.76% 9 3 3 2 1 83.13% K1 2.292 2.315 2.344 2.360   K2 2.305 2.374 2.488 2.329   K3 2.335 2.243 2.100 2.243   k1 0.764 0.772 0.781 0.787   k2 0.768 0.791 0.829 0.776   k3 0.778 0.748 0.700 0.748   极差r 0.014 0.044 0.129 0.039 主次顺序C>B>D>A 优水平 A3 B2 C2 D1   优组合 A3B2C2D1

纺织废水中往往含有Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Na⁺等金属离子(Murugesan et al., 2009)，为探究各离子对脱色效果的影响，在正交试验所得的最优条件下分别添加氯化钴、硫酸钠、硫酸亚铁、硫酸镁、氯化锰、硫酸铜、氯化钙、氯化钾、碘化钾，浓度分别为0、0.5、1、5、10 mmol · L^-1.结果表明，对脱色作用具有促进作用的离子有：Na⁺、Mg²⁺、Cu²⁺，但在试验范围内促进作用不显著；具有抑制作用的离子有Co²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、I^-(图 7)，10 mmol · L^-1的浓度可使脱色率降低50%以上；其中Mn²⁺的抑制作用尤为显著，0.5 mmol · L^-1的浓度就使脱色率减小50%以上.通过KCl和KI的比较试验，可以看出，I^-浓度为10 mmol · L^-1时脱色率只有17.01%，具有很强的抑制作用，因为I^-可以抑制酶活，从而降低脱色率.

图 7(Fig. 7)

图 7 不同离子对漆酶催化酸性黑ATT脱色的影响 Fig. 7 Effects of metal ions on decolorization of Acid Black ATT catalyzed by laccase

铜离子在浓度小于1 mmol · L^-1时，对脱色略有促进作用，而随着铜离子浓度的上升，脱色率明显下降.Cu²⁺是漆酶的组成部分，也是其活性中心，适量的Cu²⁺对漆酶的活性有促进作用(Murugesan et al., 2009).但是高浓度铜离子却会起反作用，因为高浓度离子对染料本身的色泽起了加深作用(赵世光等，2013).

EDTA-钠是一种络合剂能够与金属阳离子形成高度稳定的水溶性络合物(林琳和袁志文，2008)，EDTA-钠能够与漆酶的铜离子结合，从而改变漆酶的活性结合位点(Khlifi et al., 2010)；SDS是一种离子型去污剂，可使蛋白质变性(张丽兰，1994).在正交试验所得的最优条件下，分别加入0、0.1、0.5、1、10 mmol · L^-1的EDTA-钠、SDS，探究酶抑制剂对脱色率的影响.结果(图 8)表明，EDTA-钠对脱色的抑制作用不显著，加入量达10 mmol · L^-1时才显现一定的抑制效果.SDS对脱色的抑制作用很强，浓度为10 mmol · L^-1时脱色率降低了68%.

图 8(Fig. 8)

图 8 酶抑制剂对漆酶催化酸性黑ATT脱色的影响 Fig. 8 Effects of enzyme inhibitors on decolorization of Acid Black ATT catalyzed by laccase

分别在脱色体系中加入0、0.1、0.5、1.0 μmol · L^-1 浓度的ABTS，0、0.5、1、5、10 mmol · L^-1浓度的HBT，探究脱色助剂对脱色率的影响.结果(图 9、10)表明，在试验范围内ABTS对脱色影响不显著；但HBT效果显著，室温下加入1 mmol · L^-1 HBT反应10 min，其脱色率可达到对照组(50 ℃)反应60 min时的脱色率(87.35%)，显著提高了漆酶的脱色效率.HBT是良好的氧化还原介质，在漆酶催化染料脱色、纸浆漂白及其它污染物降解过程中起着重要作用(Murugesan et al., 2007b)，Murugesan等(2007a)的研究表明HBT是Pleurotus sajor-caju和G. lucidum所产漆酶脱色的最佳助剂.漆酶-HBT介质系统对降 解Acid Red 1、Reactive Black 5、reactive red 239、reactive yellow 15、reactive blue 114等染料非常有效(Tavares et al., 2009; Zeng et al., 2011). HBT浓度为1.0 mmol · L^-1时效果最佳(脱色率可达90.81%)，浓度大于1.0 mmol · L^-1以后促进作用反而降低(图 10)，因为HBT超过一定浓度时，其形成的自由基对漆酶的酶活有抑制作用(Daassi et al., 2012).

图 9(Fig. 9)

图 9 ABTS对漆酶催化酸性黑ATT脱色的影响 Fig. 9 Effects of ABTS on decolorization of Acid Black ATT catalyzed by laccase

图 10(Fig. 10)

图 10 HBT对漆酶催化酸性黑ATT脱色的影响 Fig. 10 Effects of HBT on decolorization of Acid Black ATT catalyzed by laccase

1)温度、pH、加酶量、染料浓度这4个因素对漆酶催化复合染料酸性黑ATT脱色的效果有显著影响.通过正交试验确定最优脱色条件为酶活9 U · mL^-1、pH 5.0、温度为50 ℃、染料浓度为0.1 g · L^-1，在此条件下的脱色率为87.35%.

2)实验证明G. lucidum wz-32粗酶液可以对偶氮染料进行直接脱色，无需加入介质，可能是未纯化的粗酶液中有充当介质的未知小分子物质.

3)金属离子Co²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、I^-对G.lucidum wz-32漆酶脱色有抑制作用，Mn²⁺和I^-尤其明显；Na⁺、Mg²⁺、Cu²⁺对脱色有一定的促进作用.酶抑制剂和脱色助剂的实验表明，EDTA-钠对脱色的抑制作用不显著，而SDS的抑制作用非常显著；HBT对脱色的促进作用显著，是非常有效的脱色助剂.