好氧颗粒污泥相比传统的絮体污泥，具有规则而紧密的微生物结构、高污泥浓度、杰出的沉降性能和耐冲击负荷等许多优越的性能(Tay et aL.，2001；Adav et aL.，2008；Liu et aL.，2004)，因此，近年来备受关注.影响颗粒污泥形成的因素很多，其中，研究者们较一致地认为颗粒污泥的形成与胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)的产生有关(Lee et aL.，2010).胞外聚合物是微生物在一定环境条件下分泌于胞外的复杂非均相高分子聚合物，是菌胶团、颗粒污泥和生物膜的重要组分，是维持污泥三维空间的重要骨架(Frolund et aL.，1996).目前，人们对好氧颗粒污泥中EPS的成分、提取方法、性能、影响因素等方面均进行了相关的研究(王怡等，2011；邹小玲等，2010；倪丙杰等，2006；王朝朝等，2012)，但好氧颗粒污泥形成过程中EPS的变化和作用机制仍然有待进一步明晰.因此，本研究通过建立一个SBR污水处理系统，分别进行普通活性污泥和好氧颗粒污泥培育，探索污泥颗粒化过程中EPS的动态变化、组分及在污泥中的空间分布.

反应器试验用水采用人工配制污水(李军等，2008)，主要成分有CH₃COONa、NH₄Cl、KH₂PO₄、FeSO₄、MgSO₄、CaCl₂和微量元素.进水COD为600~800 mg · L^-1，氨氮为50~60 mg · L^-1，总磷为9 mg · L^-1左右.试验接种的污泥来源于浙江省杭州市一座城镇污水处理厂二沉池.

反应器高100 cm，直径10 cm，有效容积为4 L，由顶部进水，每周期出水2 L，系统采用时间控制器进行控制，周期均为4 h.本试验根据不同运行工况可分为3个阶段：第1阶段(0~28 d)，进水10 min，曝气3 h，沉淀40 min，出水和闲置10 min；第2阶段(28~46 d)，沉淀时间由40 min缩短为10 min；第3阶段(46~72 d)，沉淀时间由10 min缩短为3 min.培养温度为室温.分别在第24、33和72 d对反应器中混合液进行EPS提取和检测.

本研究将总EPS按照组分与细菌分离难易程度及其空间分布分为3类：溶解性EPS、松散结合型EPS和紧密结合型EPS(Sheng et aL.，2010).其中，溶解性EPS是指与细胞薄弱连接或溶解在污泥所处系统中由细胞分泌或自溶产生的高分子聚合物；松散结合型EPS是指位于结合型EPS外沿，没有明显边界、松散分散分布的黏性层；紧密结合型EPS是指位于结合型EPS内部，与细胞表面紧密稳定结合的具有特定形状的黏性层.同时采用EPS中的两大组分蛋白质和多糖之和来表征总EPS.

污泥预处理和EPS提取采用加热离心法(McSwain et aL.，2005；蔡春光，2004；张丽丽等，2007).取泥，泥量为烘干后120~200 mg(如4000 mg · L^-1可取40 mL)；将样品在4000 r · min^-1下离心15 min，取上清液检测溶解性EPS(Soluble EPS，S-EPS)；之后再将样品在4 ℃、10000 r · min^-1(Sigma 3218K型高速离心机)下离心15 min，取上清液检测松散结合型EPS(Loosely-bound EPS，LB-EPS)；重新悬浮在去离子水中，重复上述离心操作，然后将其置于玻璃匀浆器内4 ℃下匀浆5 min，使样品均一化(匀浆的目的是让聚合物充分暴露，若为颗粒污泥需要捣碎才能尽可能多的提取EPS)，加入蒸馏水稀释到40 mL，搅匀，放入80 ℃水浴锅加热60 min，将样品在4 ℃、12000 r · min^-1下离心30 min，得上清液检测紧密结合型EPS(Tightly-bound EPS，TB-EPS);过0.22 μm的滤膜，取样5 mL左右，同时取100 mL混合液测定VSS，最终采用单位质量污泥所产生的EPS来表征反应器系统中的EPS浓度.

蛋白质的测定采用改良型BCA蛋白质测定测试盒(上海生工：Modified BCA Assay Kit，Smith et aL.，1985)，多糖的测定采用蒽酮硫酸法(Koehler，1952).

EPS分布的分析采用激光共聚焦扫描电子显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM)(李军等，2008；Garny et aL.，2008).将从反应器中取出的样品放置于液体的冷冻介质(Frozen Section Medium Neg-50，Richard Allan Scientific)中大约15~20 min，等待冷冻介质完全渗入样品后，将其置于冷冻切片机(Leica，Germany)上快速冷冻.样品污泥可以从赤道横截面方向被切成不同厚度的薄片，也可完整地使用.本试验使用被荧光染料Alxea-488(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)标记的稀释比例为1 ∶ 10的金橙黄色孢盘菌凝集素荧光染色剂AAL-488(Vector，Bulingame，California，USA)对样品污泥中EPS成分进行染色，该染色剂荧光的发射波长为488 nm.对于样品污泥中的细菌成分，本试验选用稀释比例为1∶ 1000的核酸染料Syto 60(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA).被该染料染色后的细菌会发射出波长为633 nm的荧光.将染色后的样品放置于一台正置式型号为TCS SP的共聚焦扫描电子显微镜(Leica，Germany)下进行观察.EPS和细菌被染色后的荧光经过激发后分别在505~545 nm和大于650 nm的波长范围内被捕捉和记录.观察使用的水镜光圈为20×0.8 NA，扫描方向为XYZ方式，扫描图像储存为512×512像素图片.

COD、氨氮、MLVSS、MLSS、SVI依照国家环保局《水和废水监测分析方法》(第4版)进行测定；污泥外观形态变化采用Motic公司的DMWB1-223PL型光学显微镜进行观察，颗粒污泥强度的测定采用Ghangrekar等(1996)的测定方法.

利用光学显微镜对接种污泥和反应器内的污泥外观形态进行观测和拍照.取运行24、33和72 d的污泥分别代表普通活性污泥期(简称“普通污泥”)、颗粒污泥形成初期(简称“颗粒初期”)和颗粒污泥形成稳定期(简称“颗粒稳定”)3个阶段.其中，普通污泥期是指污泥以絮体形式存在，絮体的大小和形态由接种期开始的明显变化直至相对稳定，且不具有颗粒化趋势的时期；颗粒污泥初期是指小颗粒初步形成且有不断增大的趋势，但其周围仍旧存在较多絮体的时期；颗粒污泥稳定期是指相较颗粒污泥形成初期，污泥颗粒明显增大、规则致密，且颗粒的大小和形态相对稳定的时期.接种污泥和3个运行工况下典型污泥的外观形态变化如图 1所示.可以看出，接种的城镇污水处理厂污泥主要是以细小絮体为主的普通活性污泥；SBR中运行24 d的污泥出现了一些大的并质轻的菌胶团，但大部分为絮体污泥；运行28 d后，减少了沉淀时间，轻质絮体污泥容易被洗出，颗粒污泥逐渐形成，第33 d的污泥已基本颗粒化，平均颗粒粒径为200 μm；46 d后继续减少沉淀时间，颗粒形成更趋于稳定，第72 d的颗粒污泥相对致密，平均粒径达到335 μm，颗粒污泥的机械强度(以完整性系数计)为98.98%，与之前相关研究中的数据相近(Ghangrekar et aL.，1996).

图 1(Fig. 1)

图 1 SBR运行过程中污泥的外观形态变化 (a.接种污泥;b.普通污泥,第24天;c.颗粒初期,第33天;d.颗粒稳定,第72天) Fig. 1 Morphological changes of sludge with time in SBR(a. inoculation sludge;b.conventional sludge,24th day;c.granular sludge at the early stage, 33rd day;d. granular sludge at the stable stage, 72nd day)

反应器中混合液污泥浓度(MLSS)和污泥容积指数(SVI)的变化如图 2所示.随着反应器的运行，MLSS逐渐增加.在前期普通活性污泥法运行阶段，MLSS缓慢增加至6.4 g · L^-1左右.沉淀时间减少至10 min时，MLSS呈现快速上升趋势；沉淀时间继续降低至3 min，筛选出沉降速度慢、沉降性能差等不利于出水水质的絮体污泥，此时MLSS有所降低，而后又缓慢上升直至最后基本稳定在10 g · L^-1左右.原接种污泥沉降性能差，SVI为123.2 mL · g^-1，之后SVI的曲线一直呈现下降趋势，直至第28 d，即沉降时间为10 min后，SVI迅速下降并渐渐稳定在50 mL · g^-1附近，进一步将沉降时间缩短后，SVI随运行时间的延长而继续降低至40 mL · g^-1附近.随着好氧污泥颗粒化的进程，MLSS逐渐升高，SVI逐渐降低，说明了污泥浓度和沉降性能的提高.

图 2(Fig. 2)

图 2 好氧污泥颗粒化培养中MLSS和SVI的变化 Fig. 2 Variations of MLSS and SVI in aerobic granulation

颗粒化前后SBR典型周期中氨氮和COD的变化如图 3所示.由图 3可知，颗粒化前后氨氮去除率均接近100%.随着氨氮快速降低直至为零，亚硝氮先增加后减少，硝氮逐渐增加，总氮基本呈现先快速下降后缓慢上升的趋势.颗粒化前后COD均呈现先快速下降后略有上升再逐渐下降的趋势，普通活性污泥的COD去除率为94.05%，好氧颗粒污泥的COD去除率为97.07%.可以看出，普通活性污泥和颗粒污泥在氨氮和有机物的去除方面几乎没有区别.

图 3(Fig. 3)

图 3 普通污泥和颗粒污泥典型周期中氨氮、亚硝氮、硝氮、总氮和COD的变化 Fig. 3 Variations of NH3-N,NO-2,NO-3,TN and COD during a typical cycle of conventional sludge and granule

颗粒化过程中总EPS、溶解性EPS、松散结合型EPS和紧密结合型EPS含量的变化如图 4所示.曝气末普通污泥、颗粒初期和颗粒稳定期污泥中总EPS含量分别为162.96、226.83和231.15 mg · g^-1(以VSS计，下同)，这说明颗粒污泥总EPS均比普通污泥高.目前存在的胞外聚合物假说认为，胞外聚合物EPS能通过架桥等作用连接和粘附细胞，从而形成颗粒污泥.结合试验结果表明，EPS在污泥的絮凝性和颗粒结构的稳定性方面都具有重要意义.溶解性EPS在普通污泥中数量极少，在颗粒初期污泥中为67.90 mg · g^-1，占总EPS的31.48%，颗粒稳定污泥中为35.32 mg · g^-1，占总EPS的22.60%，这表明颗粒污泥中溶解性EPS都高于普通污泥，且颗粒形成初期增长明显.观察图 4可以得出颗粒化过程中存在松散结合型EPS，但相比总EPS，松散结合型EPS含量较低且变化幅度不大.曝气初期，颗粒污泥中松散结合型EPS均高于普通污泥，随着曝气时间的延长，有下降的趋势，在此过程中，松散结合型EPS是否被细菌利用、降解或转化成其他物质还有待更进一步的研究.此外，曝气末普通污泥中紧密结合型EPS为161.06 mg · g^-1，占总EPS的98.83%.颗粒初期污泥中含有155.42 mg · g^-1，占总EPS的68.52%，颗粒稳定期污泥中为178.92 mg · g^-1，占总EPS的77.40%.不难看出，3类污泥中EPS含量均以紧密结合型EPS为主要成分.对比曝气起点和终点紧密结合型EPS变化的幅度发现，普通污泥差值为50.27 mg · g^-1，颗粒初期差值缩小为15.84 mg · g^-1，颗粒稳定期进一步缩小为6.12 mg · g^-1，这说明紧密结合型EPS含量在颗粒污泥系统中相对稳定，而普通污泥系统中的EPS受沉淀和厌氧期的影响较大，这可能是普通污泥没有颗粒污泥更为密实结构的原因.

图 4(Fig. 4)

图 4 颗粒化过程中总EPS、溶解性EPS、松散结合型EPS和紧密结合型EPS含量的变化 Fig. 4 Variations of total, soluble, loosely-bound and tightly-bound EPS in aerobic granulation

颗粒化过程中蛋白质和多糖含量的变化如图 5所示.普通污泥和颗粒污泥中蛋白质含量均高于多糖，是污泥EPS中的主要成分.对比曝气周期终点，普通污泥中蛋白质为152.24 mg · g^-1(以VSS计，下同)，占总EPS的93.42%，颗粒初期污泥中蛋白质为214.37 mg · g^-1，占总EPS的94.51%，颗粒稳定期污泥中蛋白质为215.76 mg · g^-1，占总EPS的93.34%.这说明颗粒形成初期蛋白质含量有明显上升，而颗粒初期和颗粒稳定期污泥中蛋白质含量相差不多，较为稳定.观察一个典型周期中蛋白质和多糖的变化趋势可以发现，除了颗粒稳定污泥30 min处蛋白质含量的特例外，蛋白质和多糖的变化趋势都是先降低后上升，这个特例的具体成因还有待进一步的研究分析.蛋白质和多糖在颗粒污泥中的含量都分别高于普通污泥中两者的含量.同时随着污泥的颗粒化，含量较少的多糖一直呈增长的趋势.这 是因为胞外多糖本身为高分子粘性物质，可以作为细胞间连接和粘附的基质，促进微生物聚集形成并稳定颗粒的三维立体结构.Tay等(2004)研究发现，颗粒污泥形成过程中多糖含量会随着剪切力的增加而急剧增加，认为EPS中多糖对颗粒污泥形成起着重要的粘结作用.且有研究表明，蛋白质比多糖更易与金属离子通过静电作用而键合，从而成为影响微生物聚集体形成的关键因素(Laspidou et aL.，2002；Dignac et aL.，1998).因此，蛋白质和多糖都能促进微生物的聚集，有利于颗粒污泥的形成.

图 5(Fig. 5)

图 5 颗粒化过程中蛋白质和多糖含量的变化 Fig. 5 Variations of protein and polysaccharide content in aerobic granulation

图 6分别为普通污泥时期絮体污泥、颗粒稳定期颗粒污泥表面和颗粒污泥内部纵断面切片的CLSM图.图中红色代表细菌，绿色代表EPS的分布.从图可以看出，呈絮体和胶团状的普通污泥，结构相对松散，体积微小，EPS和细菌的分布较为均匀，两者交织粘接.污泥颗粒体积明显变大，呈现规则球形，表面密实，颗粒表面分布着大量细菌和EPS，其中，细菌的分布面积大于EPS.污泥颗粒纵断面显示出细菌主要分布在颗粒的表面，在其内部细菌数量明显减少，主要分布的是EPS.由于颗粒污泥有着比絮体污泥更大的体量和更致密的结构，在颗粒化的过程中，细菌分泌的EPS实际上成为细菌相互粘结的类似胶水的物质，有利于颗粒形成和增大.随着颗粒粒径的增加，颗粒污泥中基质传递的阻力也随之增大，细菌不断向表面迁移从而能获得足够的食物和氧，这可能是造成细菌和EPS分布变化的主要原因.

图 6(Fig. 6)

图 6 普通污泥和颗粒污泥中细菌(红色)和EPS(绿色)的分布变化 (a.普通污泥絮体表面，b.污泥颗粒表面,c.污泥颗粒断面) Fig. 6 Changes of distribution of bacteria (red) and EPS (green) in floc and granule(a. a floc surface,b. a granular surface,c. a granule section)

1)颗粒污泥相比普通活性污泥，反应器中的MLSS可达到10 g · L^-1，SVI可达到40 mL · g^-1，两者COD和氨氮的处理效率近似.

2)普通污泥和颗粒污泥中蛋白质含量均高于多糖，是污泥EPS中的主要成分.颗粒形成初期蛋白质含量有明显上升，一个典型周期中蛋白质和多糖的变化趋势普遍是先降低后上升，蛋白质和多糖在颗粒污泥中的含量都分别高于普通污泥中两者的含量.同时随着颗粒化过程，含量较少的多糖一直呈增长的趋势.

3)颗粒污泥中总EPS和溶解性EPS含量均高于普通污泥，且颗粒形成初期溶解性EPS增长明显.颗粒化过程中存在松散结合型EPS，但含量较低且变化幅度不大.曝气初期，颗粒污泥中松散结合型EPS均高于普通污泥，随着曝气时间的延长，有下降的趋势.3类污泥中EPS含量均以紧密结合型EPS为主要成分，紧密结合型EPS含量在颗粒污泥中相对稳定.

4)CLSM图像显示，好氧污泥颗粒表面分布着细菌和EPS，其中心主要分布的是EPS.