东南景天是我国原生的重金属超积累植物(Yang et al., 2002)，已广泛用于植物对重金属锌(Zn)/镉(Cd)超积累作用的机制研究中(Xiao et al., 2013; Zhang et al., 2013; Li et al., 2007).矿山型东南景天有很强的Cd吸收富集能力，叶片与茎中Cd含量最大可分别达到9000和6500 mg · kg^-1(Yang et al., 2004).目前，通过植物与其根际微生物的相互作用提高植物修复效率被认为是一条环境友好、经济可行的技术途径(Shin et al., 2012)，并已成为国内外研究热点，但针对东南景天与其根际内生菌的相互作用研究还较少.Long等(2011)用LB培养基从Zn/Cd等重金属污染土壤中生长的东南景天中分离到14个耐受重金属的菌株；Zhang等(2012)用以1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)为唯一氮源的培养基从东南景天中筛选到85个耐受重金属的细菌菌株，并发现其中3个菌株能促进东南景天的生长，提高Cd的修复效率.

由于大多数超积累植物生物量小，生态适应性较差，因此，增强生物量较大的非超积累植物(如油菜、高梁)的重金属积累能力为植物修复提供了新的思路(Luo et al., 2012;Sheng et al., 2008).已有研究表明，将从超积累植物分离的特异内生菌接种于非宿主植物中，不仅可以成功地定殖，而且还可以促进受体植物的生长，提高修复效率(Marques et al., 2013).如从超积累植物毛竹中分离的一株拉恩氏菌株JN6可成功在油菜体内定殖，促进油菜生长，提高油菜对Cd、Pb、Zn的吸收(He et al., 2013)；从长白松根系中分离的苏云金芽胞杆菌GDB-1可以促进Pb超积累植物赤阳皮的生长，提高植物对As、Cu、Pb、Ni和Zn等重金属的积累量(Babu et al., 2013).但目前对东南景天内生菌的相关研究尚未见报道.因此，本文拟以矿山型东南景天为材料，分离对镉具有耐性的内生菌株，并将其接种到油菜中，以筛选能促进油菜生长，提高油菜镉积累量的特异菌株，用于镉污染土壤的植物修复.

矿山型东南景天采自浙江省衢州市一个古老的矿区(Zhang et al., 2012)，油菜选用镉富集品种溪口花籽(苏德纯等，2002).

基础培养基：每升培养液中含有KH₂PO₄ 4 g，Na₂HPO₄ 6 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，葡萄糖2 g，葡萄糖酸钠2 g，柠檬酸2 g，组分1、组分2溶液各0.1 mL，琼脂15 g，溶剂为水，pH值7. 2，高压蒸汽灭菌(121 ℃，20 min).其中，组分1：H₃BO₃ 10 mg，MnSO₄·H₂O 11.19 mg，ZnSO₄·7H₂O 124.6 mg，CuSO₄·5H₂O 78. 22 mg，MoO₃ 10 mg，溶于100 mL灭菌蒸馏水中，-4 ℃保存；组分2：FeSO₄·7H₂O 100 mg溶于10 mL灭菌蒸馏水中，-4 ℃保存.

纯化培养基(LB培养基)：每升培养液中含有胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，溶剂为水，pH=7.0，高压蒸汽灭菌(121 ℃，20 min).筛选培养基是在纯化培养基中添加10 mg · L^-1 Cd²⁺.

SMS培养基：每升培养基中含有蔗糖10 g，(NH₄)₂SO₄ 1 g，KH₂PO₄ 2 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，NaCl 0.1 g，酵母提取物 0.5 g，CaCO₃ 0.5 g，溶剂为水，pH值7. 2，高压蒸汽灭菌(121 ℃，20 min).

NBRIP培养基：葡萄糖10 g，Ca₃(PO₄)₂ 5 g，MgCl₂·6H₂O 5 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH₄)₂SO₄ 0.1 g.

华南农业大学叶菜B配方(mg·L^-1)：Ca(NO₃)₂·4H₂O 472，KNO₃ 202，NH₄NO₃ 80，KH₂PO₄ 100，K₂SO₄ 174，MgSO₄·7H₂O 46.

微量元素配方(mg · L^-1)：FeSO₄·7H₂O 27.8，EDTA-2Na 37.2，H₃BO₃ 2.86，MnSO₄·4H₂O 2.13，ZnSO₄ 0.22，CuSO₄·5H₂O 0.08，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.02.

用去离子水清洗从矿山采集的植物样品，保留根部，置于70%的酒精中浸泡5 min，再放于0.1% HgCl₂溶液中浸泡3 min，然后用无菌水清洗5次(Sheng et al., 2008).灭好菌的根系组织置于装有灭菌石英砂的无菌研钵中，加入1 mL无菌的0.9% NaCl溶液进行研磨.分别取不同稀释倍数的研磨液100 μL涂布于以ACC为唯一氮源的基础培养基中(Belimov et al., 2005)，于30 ℃培养3 d，挑取形态各异的菌落于纯化培养基上，置于30 ℃继续培养3 d，选取单菌落接种于10 mg · L^-1 Cd²⁺筛选培养基，置于30 ℃继续培养，3 d后选取生长良好的单菌落用于下面的实验.

挑取候选单菌落接种于LB液体培养基中预培养24 h，吸取100 μL预培养菌液接种于含不同浓度重金属或抗生素的LB液体培养基中，置于30 ℃，120 r · min^-1的摇床中培养5 d.其间测定培养基的OD₆₀₀以确定菌落的生长情况，能完全抑制菌株生长的最低重金属浓度即为最小抑制浓度(MIC).其中，重金属Cd²⁺浓度设置为10、20、30、40、50、100、300、500、700、900 mg · L^-1，Pb²⁺浓度设置为200、400、600、800、1000、1200、1400、2000 mg · L^-1，氨苄霉素(AMP)、四环素(TC)、卡那霉素(KM)、庆大霉素(GM)和链霉素(SM20)的浓度分别为150、10、50、20、50 μg · mL^-1.

产IAA检测：参照Sheng等(2008)描述的方法，将候选菌株接种到含有0.5 mg · mL^-1 L-色氨酸的SMS培养基中，置于30 ℃、150 r · min^-1的摇床中培养3 d，8000 r · min^-1离心后取上清液用紫外分光光度计在530 nm处测定吸光值，与IAA标准曲线比对计算IAA浓度.

嗜铁素检测：用CAS平板法(Schwyn et al., 1987)检测细菌产生分泌嗜铁素的能力.

溶磷性检测：采用(Nautiyal，1999)描述的方法，在NBRIP培养基中加入磷酸三钙，向100 mL培养基中加入0.5 mL菌液(大约1×10⁸ CFU · mL^-1)，置于30 ℃、150 r · min^-1的摇床中培养5 d，6000 r · min^-1离心后取上清液，用钼蓝比色法测定磷含量.

采用石英砂作为基质，用育苗盘进行油菜砂培实验.油菜种子先用0.1%的HgCl₂浸泡3 min，再用70%的酒精浸泡1 min进行表面消毒，然后用无菌水冲洗3次.消毒的种子种植于盛有石英砂的托盘中，放置于恒温光照培养箱中育苗1周.选取生长一致的油菜移栽于育苗盘中，每个孔移栽1株.根据生长情况，向石英砂中加入营养液，营养液采用华南农业大学叶菜B配方，并添加50 μmol · L^-1 Cd溶液. 每周向石英砂中加入20 mL OD₆₀₀= 1.0的菌悬液，对照组中加入等量的去离子水.

移栽30 d后分别收获油菜幼苗地上部与根部，测定鲜重；用0.01 mol · L^-1的EDTA溶液冲洗植株表面，再用去离子水反复冲洗，置于80 ℃烘箱烘干，测定干重.烘干样品用磨样机(Retsch，MM-301，Germany)磨成粉末，分别称取0.2 g地上部和0.1 g根部样品，用浓硝酸-高氯酸(体积比5 ∶ 1)消煮，消煮液定容至20 mL，用ICP-MS测定Cd含量(Zhang et al., 2012).

筛选得到的特异内生菌按照细菌鉴定手册(东秀珠等，2001)测定其生理生化性状，通过16S rDNA基因序列进行分子鉴定.用上海生工生物的柱式细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA，分别合成PCR扩增引物，序列为27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)(Byers et al., 1998).PCR反应程序为94 ℃ DNA变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，进行30个循环，扩增产物纯化后送华大基因进行测序.将16S rDNA基因序列通过Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行相似序列搜索，根据最相似序列确定其系统发育地位；用ClustX对序列进行对位排序，MEGA 4.1(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)计算遗传距离，邻位相结法(Neighbor-joining)构建系统发育进化树.

挑取筛选到的菌株于LB培养基中，30 ℃、150 r · min^-1下振荡培养24 h.吸取菌液用适量的生理盐水稀释至OD₆₀₀= 0.1制成菌悬液，吸取100 μL菌悬液接入装有10 mL LB液体培养基的试管中.每6 h取样一次，用分光光度计在600 nm处测定吸光值(OD₆₀₀)，每次做3个重复，以OD₆₀₀表示该菌株的生长量.

挑取筛选到的菌株于LB培养基中，30 ℃、150 r · min^-1下振荡培养24 h.吸取菌液用适量的生理盐水稀释至OD₆₀₀= 0.1制成菌悬液，取1 mL菌悬液接种于100 mL LB培养基中，在不同温度(20、25、30、35、40 ℃)、150 r · min^-1下振荡培养3 d后测定OD₆₀₀.

配制不同pH(3、5、7、9、11)的LB培养基，将上述菌悬液1 mL接种于100 mL LB培养基中，30 ℃、150 r · min^-1下振荡培养3 d后测定OD₆₀₀.

数据采用Microsoft Excel 2010和DPS 6.55统计软件进行处理，用Duncan′s方法进行差异显著性分析.

经过连续的富集、分离、纯化，从矿山型东南景天表面灭菌的根部分离得到30个细菌菌株，其中，4株在含10 mg · L^-1 Cd²⁺的筛选培养基上可以很好地生长，并获得形态一致的单菌落，分别命名为SaN1、SaN2、SaN3和SaN7用于下一步研究.

通过液体培养，研究了候选菌株对Cd和Pb的耐性，发现不同菌株的耐性差异较大(表 1).对Cd的耐性以SaN1最强，SaN7最弱，其中，镉对SaN1的最小抑制生长浓度是SaN7的50倍.SaN2与SaN3耐Cd性相似，都是20 mg · L^-1.对Pb的耐性也是SaN1最强，达到1000 mg · L^-1，其次是SaN2(600 mg · L^-1)，而SaN3的Pb最小抑制浓度仅为200 mg · L^-1.

表1(Table 1)

表1 候选菌株的重金属和抗生素抗性及促生潜力 Table 1 Tolerance of heavy metals and antibiotics，potential of promoting plant growth of the four bacteria c and idates

表1 候选菌株的重金属和抗生素抗性及促生潜力 Table 1 Tolerance of heavy metals and antibiotics，potential of promoting plant growth of the four bacteria c and idates 菌株 MIC/(mg·L-1) 抗生素 促生特性 Cd Pb KM AMP SM20 GM TC IAA/ (mg·L-1) 溶磷性/ (mg·L-1) 铁载体 注：数据之间的显著性差异用Duncan′s检验，同一列字母不同表示处理间有显著差异(p<0.05)，字母相同表示处理间无显著差异. SaN1 500 1000 + + - + - 76.57±10.20a 67.53±9.60a + SaN2 20 600 - + + - - 77.43±7.80a 13.05±4.30b + SaN3 20 200 + - + - - 30.23±5.10b 10.2±3.20c + SaN7 10 400 - + - + - 27.55±4.80c 13.5±2.80b +

由表 1还可知，候选的4菌株对四环素(TC)都没有抗性，SaN1、SaN3能抗卡那霉素(KM)；除SaN3外，其他3菌株均抗氨苄霉素(AMP)；SaN2与SaN3可抗链霉素(SM20)；SaN1与SaN7对庆大霉素(GM)有抗性.

对候选菌株的促生潜力进行了研究(表 1)，发现4菌株均可以产生IAA，其中，SaN1和SaN2产生的IAA量显著高于SaN3和SaN7.4菌株都有一定的溶磷特性，以SaN1菌株的溶磷性最强，可以达到67.53 mg · L^-1，并且它们均可产铁载体.

采用砂培试验，研究了接种候选菌株对油菜植株生长和镉积累的影响(图 1).结果发现，接种SaN1和SaN2显著提高了地上部和根部生物量，其中，SaN1处理后地上部鲜重与干重分别提高18.6%和24.9%，根系的鲜重与干重提高23.1%和25.3%;SaN2处理对植株生物量的促进作用低于SaN1处理，但二者间差异不显著.而SaN3和SaN7处理后植株生物量略有增加，但与对照处理差异不显著(图 1).

接种菌株后，油菜地上部与根部的Cd含量及积累量有不同程度的增加(图 1).与对照相比，SaN1处理差异极显著，油菜地上部和根部Cd积累量分别提高了45%和58.7%；接种SaN2后，油菜地上部Cd积累量提高了25%，但与对照处理的差异不显著，根部镉积累量显著增加，提高了39.9%；而接种SaN3和SaN7后，油菜植株Cd含量及Cd积累量并没有显著性提高，处理效果不明显(图 1).

图 1(Fig. 1)

图 1 不同菌株处理油菜生物量、Cd含量与Cd积累量(数据之间的显著性差异用Duncan′s检验，p<0.05，同一图中字母不同表示处理间有显著差异，字母相同表示处理间无显著差异) Fig. 1 The fresh weight，dry weight，Cd concentration and Cd accumulation of oilseed rape plants treated with the four bacteria c and idates

由于SaN1菌株对Cd、Pb具有较高的耐性，可耐多种抗生素，并且接种到油菜后，作用效果最显著(图 1)，因此，将其选定为目标菌株，进行进一步研究.首先，按照细菌分类手册对其进行了生理生化鉴定(表 2)，发现该菌株具有淀粉水解和硝酸盐还原能力，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖等多种糖类作为其碳源，经革兰氏染色检测为阳性.

表2(Table 2)

表2 SaN1菌株的生理生化鉴定 Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain SaN1

表2 SaN1菌株的生理生化鉴定 Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain SaN1 试验项目 结果 试验项目 结果 注：+ Positive，-Negative. 葡萄糖 + 淀粉水解 + 蔗糖 + 硝酸盐还原 + 果糖 + 革兰氏染色 + 肌醇 - V.P实验 + 明胶水解 - 吲哚实验 +

利用PCR方法扩增了该菌株的16S rDNA，并进行了测序，所获得序列已提交至Genbank数据库，登录号为KC961951. BlastX序列联配结果显示，该菌与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterum)的序列相似度达到99%，进一步将已知细菌的16S rDNA序列与该序列构建系统发育树(图 2)，对比证实该序列与巨大芽孢杆菌亲缘关系最近.

图 2(Fig. 2)

图 2 基于16S rDNA序列构建的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences

研究了SaN1的最适生长温度及pH对SaN1菌株生长的影响(图 3).由图 3a可知，20~30 ℃时，SaN1的生长速率随温度的提高而显著提高；随着温度的进一步升高，其生长速率开始下降，到40 ℃时菌体生长受到明显抑制. 由图 3b可知，pH在3~7范围内，菌株的生长量随pH升高而增加；而在7~9范围内，菌株的生长量随pH升高而降低；在极酸性(pH＜5)或极碱性(pH＞9)条件下，SaN1的生长均受到明显抑制.

图 3(Fig. 3)

图 3 温度和pH对SaN1 菌株生长的影响 Fig. 3 Effect of temperature and pH on the growth of strain SaN1

测定了SaN1在LB培养基中的常规生长曲线(图 4)，发现该菌株在培养开始的前12 h生长缓慢，在12~42 h呈对数增长，42~54 h进入稳定期，之后进入衰亡期(图 4).

图 4(Fig. 4)

图 4 SaN1的生长曲 Fig. 4 Growth curve of SaN1

植物提取修复以其高效、低廉、生态友好、无二次污染等优势被国内外学者认为是最有前景的修复技术(Shin et al., 2012).然而，植物提取过程主要有三方面的限制因素：①重金属在土壤中的低生物有效性，②重金属从植物根系到地上部的低转运率，③修复植物的低生物量(Chen et al., 2010; Guo et al., 2010).因此，如何提高植物提取修复的效率成为植物修复技术能否大规模应用的关键.在长期进化过程中，植物体内共生了很多微生物，其中，某些微生物可以促进植物生长，提高抗逆性，从而增强植物对环境变化的适应性(Hardoim et al., 2008; Weyens et al., 2009)，这些有益微生物就是近年来国内外研究关注的热点—植物内生菌.早有报道证实，从重金属耐性植物中筛选出的内生菌具有较高的重金属耐性，能帮助植物适应重金属毒害(Idris et al., 2004)，促进植物生长，提高植物修复效率(Glick，2010; Ma et al., 2009).本研究从镉超积累植物东南景天根部筛选到4株内生细菌，发现它们均可以产生IAA和铁载体，并且具有溶磷性(表 1).已有报道表明，菌株能够产生一种植物促生物质，便具有促进植物生长潜力(Rajkumar et al., 2009)，因此，本研究的4个菌株可能有很好的促生效果，并且它们还对多种抗生素具有抗性(表 1).Strobel(2003)研究认为，某些内生菌可分泌抗生素以增强植物对病原菌的抗性，提高植物的竞争力，这可能是内生菌促生作用的机制之一.

利用植物内生菌提高植物提取修复效率已有较多研究，如两株从油菜根部筛选出的内生菌假单胞菌G10、细杆菌G16可以促进油菜的生长，提高油菜对Pb的吸收(Sheng et al., 2008)；一株从商陆中筛选得到的芽孢杆菌SLS18可以促进甜高粱生长，促进其对Mn/Cd的吸收(Luo et al., 2012).而对我国原生锌/镉超积累植物东南景天根际内生菌的研究尚不多见.Li等(2007)从东南景天根系中分离的伯克氏菌可显著地促进东南景天的生长和对重金属的积累.最近研究发现，一株东南景天内生菌贪噬菌可以显著提高东南景天的生物量，促进Zn吸收，提高重金属转移速率，提高植物的抗逆性(Zhang et al., 2013)；一株鞘氨醇单胞菌可促进东南景天生长，提高东南景天对Cd的吸收(Zhang et al., 2013).然而将这些内生菌接种到非寄主植物的效果如何尚不得而知.油菜是一种生物量较大的植物，不仅对镉具有较强的富集能力，而且还是一种能源植物，应用于镉污染土壤的植物修复具有得天独厚的优势.本研究从镉超积累植物东南景天中分离到一株特异内生菌，接种到油菜后，发现它不仅可以很好地促进油菜生长，同时可以显著提高油菜对镉的积累能力(图 1)，这对于利用油菜-东南景天内生菌系统修复污染土壤，特别是镉中轻度污染土壤具有十分重要的意义，且具有广阔的应用前景.

本研究从Cd超积累植物东南景天根部分离到4株对镉具有较强耐性的内生菌，发现它们均具有较好的促生潜力，对多种抗生素具有耐性.通过砂培试验比较了它们对油菜的促生效果及对镉吸收积累的影响，发现其中一株特异内生菌SaN1对油菜具有显著的促生效应，并且可大幅提高油菜植株体内镉含量和油菜对镉的积累量.经生理生化及分子鉴定表明，该菌株属于巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)，且在25~30 ℃，pH值中性条件下生长良好，将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(保藏编号为CGMCCNo.7295)，以用于进一步研究.