酸雨(Acid rain，AR)是全球主要的环境问题之一，研究表明，酸雨已覆盖我国国土面积的40%左右，我国已成为继北欧和北美之后世界第三大酸雨区(Feng et al., 2002)．酸雨对植物最直接的影响就是造成叶片胞外H⁺浓度增加.质膜功能蛋白H⁺-ATPase被誉为植物的主宰酶，参与转运胞内H⁺和植物对逆境胁迫的响应(杨颖丽等，2006).Kim等(2013)研究发现，低温环境会引起亚麻荠叶片质膜H⁺-ATPase活性升高，产生H⁺和能量，以此抵抗低温胁迫，胁迫结束后质膜H⁺-ATPase活性会随着外界温度的逐渐升高而降低.Geilfus等(2013)研究表明，质膜H⁺-ATPase通过转运H⁺可以缓解由NaCl胁迫造成的蚕豆叶片细胞内的碱性环境．本课题组前期研究表明(葛雨晴等，2013)，AR胁迫下质膜H⁺-ATPase活性变化与植物对酸雨的耐受性相关.质膜H⁺-ATPase活性变化受多因素调节，其中，质膜H⁺-ATPase磷酸化的翻译后共价修饰活性的调节是质膜H⁺-ATPase活性调节机理之一(Desbrosses et al.，1998)，磷酸化的蛋白激酶活性依赖于胞内Ca²⁺的浓度(鲁翠涛等，2006).Ca²⁺可以作为第二信使，当细胞受到刺激时，Ca²⁺顺着电化学梯度进入胞质，胞质Ca²⁺浓度升高转导内、外因信号，进而引起一系列应激反应以此调节H⁺-ATPase活性(宋秀芬等，2001).目前，国内外关于H⁺-ATPase和Ca²⁺在植物响应逆境胁迫下的作用已有大量报道.然而，鲜有关于非生物逆境胁迫下植物中Ca²⁺浓度变化对H⁺-ATPase活性影响的研究.那么AR胁迫下质膜H⁺-ATPase活性变化是否受胞内Ca²⁺浓度调节？AR胁迫下两者之间是怎样的关系？阐明这些关键问题，可进一步揭示质膜H⁺-ATPase响应酸雨胁迫的活性调节机制.基于此，本文以属耐酸性的粮食作物水稻为试材，以胞内H⁺浓度、质膜H⁺-ATPase活性、胞内Ca²⁺浓度、质膜Ca²⁺-ATPase活性为指示参数，探讨模拟酸雨胁迫对水稻叶片质膜H⁺-ATPase活性与胞内Ca²⁺浓度的影响，研究Ca²⁺对质膜H⁺-ATPase响应酸雨胁迫的活性调节作用，以期为丰富植物抗酸雨胁迫机理研究提供基础数据.

供试水稻(Oryza sativa)为淮稻8号.挑选籽粒饱满的种子，用0.1%HgCl₂消毒10 min，去离子水浸泡2 d后置于25 ℃恒温光照培养箱中催芽4 d，然后将幼芽放在蛭石里培养20 d，待幼苗长至2叶1心期移入6.88 L周转箱中进行水培，营养液采用国际水稻研究所(IRRI)常规营养液配方，并略做修改(狄廷均等，2007).培养的光照强度为300 μmol · m^-2 · s^-1，光照12 h，昼/夜温度为30 ℃/24 ℃，相对湿度为60%.营养液每隔3 d换1次，待幼苗长至3叶1心期进行酸雨处理.

模拟酸雨成分为SO^2-₄/NO^-₃(3 ∶ 1，V/V)(Chen et al., 2010).先配制pH=1.0的AR母液，用去离子水稀释成pH=2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、5.5的模拟酸雨，然后用喷雾器均匀喷施在叶片上，滴液为限，对照组喷施等量的pH=7.0的溶液.连续喷5 d(胁迫期)，取同一叶位的叶片进行指标测定.将未取过样且酸雨处理过的水稻幼苗移至对照条件下培养5 d(恢复期)，再取样测定指标.

用酶解法提取水稻叶片原生质体(Yemelyanov et al., 2001)，分别采用BCECF-AM、Fluo4-AM荧光探针染料标记细胞，通过流式细胞仪测定胞内H⁺、Ca²⁺荧光强度来表示胞内H⁺浓度(Undem et al., 2012)、Ca²⁺浓度(Li et al., 2012).质膜H⁺-ATPase活性(狄廷均等，2007)、Ca²⁺-ATPase活性(李裕红等，2006)的测定采用无机磷含量法.

处理组与对照组设置3次重复，所有数据均为3次独立试验的平均值±标准误差(Mean±SD)，所有数据平均值、标准误差、差异显著性用SPSS16.0软件分析.

由图 1a可知，胁迫期与CK(pH=7.0)相比，pH=5.5和5.0处理组胞内H⁺浓度变化不显著，说明低强度AR对水稻幼苗无明显伤害；pH=4.0和3.5处理组胞内H⁺浓度升高，这与Liu等(2011)研究结果一致，AR致使水稻幼苗质膜损伤，通透性增强，导致胞外H⁺进入胞质；在pH=3.0和2.5的AR胁迫下，胞内H⁺浓度降低，推测造成上述结果的原因是，质膜H⁺-ATPase为了适应外界酸性环境，H⁺/ATP耦合比增加并且H⁺/ATP浓度比例失去平衡(Astolfi et al., 2005)，导致H⁺浓度降低.恢复期，与CK相比，pH=5.5和5.0处理组胞内H⁺浓度仍然没有显著变化；pH=4.0和3.5处理组胞内H⁺浓度已恢复到CK水平；pH=3.0和2.5处理组胞内H⁺浓度显著低于CK，但相对于胁迫期有所恢复.可能是因为此时H⁺-ATPase在胁迫期受到的可逆伤害恢复后其结构趋于稳定，H⁺/ATP耦合比降低进而释放H⁺，故胞内H⁺浓度升高.

图 1(Fig. 1)

图 1 不同pH值模拟酸雨对胞内H+浓度(a)和质膜H+-ATPase活性(b)的影响(不同大小写字母分别表示胁迫期和恢复期各处理间差异显著(p<0.05)) Fig. 1 Effects of acid rain at different pH values on intracellular H+ concentration(a) and H+-ATPase activity(b)in plasma

由图 1b可知，胁迫期pH=5.5和5.0处理组质膜H⁺-ATPase活性与CK相比变化不显著，说明低强度酸雨没有引起质膜功能酶H⁺-ATPase活性发生变化；pH=4.0和3.5处理组质膜H⁺-ATPase活性升高，且pH=3.5处理组H⁺-ATPase活性最大，结合胞内H⁺浓度在pH=3.5处理组中达到最高值分析可知，下降的pH值刺激诱导了转运H⁺的主要质膜功能蛋白H⁺-ATPase活性升高；pH=3.0和2.5处理组质膜H⁺-ATPase活性降低，推测高强度酸雨引发细胞内活性氧过量累积，引起膜脂过氧化(宫海军等，2003)，进而降低膜脂不饱和脂肪酸含量及膜的流动性，致使H⁺-ATPase的构象发生变化而最终导致其活性降低.恢复期，pH=4.0和3.5处理组质膜H⁺-ATPase活性相对于胁迫期有所回落，接近CK水平，可能是因为此时胞内H⁺浓度已下降，转运H⁺的主要质膜功能蛋白H⁺-ATPase活性也随之降低；pH=3.0和2.5处理组H⁺-ATPase活性高于胁迫期，原因可能是虽然恢复期翻译后共价修饰的调节(Michelet et al., 1995)及磷酸化水平上升(凌启阆等，1998)使质膜H⁺-ATPase活性有所升高，但AR引发的质膜损伤已超过水稻自身的修复能力，质膜H⁺-ATPase活性依然低于对照.由上可知，与胁迫期相比，恢复期质膜H⁺-ATPase活性均向CK水平有不同程度的靠近，恢复效果受AR强度制约.

由图 2a可知，胁迫期与CK(pH=7.0)相比，pH=5.5和5.0处理组Ca²⁺浓度变化不显著；pH=4.0和3.5处理组Ca²⁺浓度升高，结合图 1a中此处理下胞内H⁺浓度上升，推测由于AR胁迫时需要大量的Ca²⁺转导胞内pH值下降信号(王海华等，2003)，故Ca²⁺通道迅速打开，Ca²⁺顺着电化学梯度进入细胞，Ca²⁺浓度增加调节蛋白激酶活性变化(鲁翠涛等，2006)，进而改变磷酸化水平以提高H⁺-ATPase活性(图 1b)，增强水稻幼苗的抗酸性；pH=3.0和2.5处理组胞内Ca²⁺浓度降低，这可能是由于高强度的AR致使Ca²⁺通道受损伤，进而造成Ca²⁺很难进入细胞，原有的游离Ca²⁺通过与蛋白结合形成钙依赖性蛋白激酶、钙调素、钙调磷酸酶B类似蛋白三类钙结合蛋白(易籽林等，2010)，这些钙信号向下游转达以适应酸雨胁迫，但调控效果受酸雨强度的影响.恢复期pH=4.0和3.5处理组胞内Ca²⁺浓度已恢复至CK水平，此时H⁺-ATPase活性已受到Ca²⁺调节恢复到正常水平，故Ca²⁺浓度也随之下降；pH=3.0和2.5处理组Ca²⁺浓度高于胁迫期且高于CK，分析原因可能是由AR引发的Ca²⁺离子通道损伤部分修复，Ca²⁺逐渐进入胞内以调节H⁺-ATPase活性，进而控制细胞内H⁺转运速率来维持胞内pH.

图 2(Fig. 2)

图 2 不同pH值模拟酸雨对胞内Ca2+浓度(a)和质膜Ca2+-ATPase活性(b)的影响 Fig. 2 Effects of acid rain at different pH values on intracellular Ca2+ concentration(a) and Ca2+-ATPase activity(b)in plasma

由图 2b可知，胁迫期与CK相比，pH=5.5和5.0处理组质膜Ca²⁺-ATPase活性无显著变化；pH=4.0和3.5处理组质膜Ca²⁺-ATPase活性升高，并在pH=3.5时最大，此处理组的胞内Ca²⁺浓度也较高，表明AR胁迫下Ca²⁺-ATPase活性会应激升高来调控胞内Ca²⁺浓度，以达到调节H⁺-ATPase活性进而维持胞内pH的目的；pH=2.5处理组质膜Ca²⁺-ATPase活性降低，这可能是由于高强度AR对膜脂结构和流动性产生影响，而Ca²⁺-ATPase嵌于质膜磷脂双分子层中(李裕红等，2006)，因此，Ca²⁺-ATPase构象会受影响，进而导致活性受抑，转运Ca²⁺能力降低，胞内Ca²⁺浓度降低(图 2b).恢复期，pH=4.0和3.5处理组质膜Ca²⁺-ATPase活性明显低于胁迫期，且恢复至接近CK水平，结合此时Ca²⁺浓度也低于胁迫期的事实可知，Ca²⁺对Ca²⁺-ATPase活性有反馈调节作用，即随着Ca²⁺浓度下降，应激上升的Ca²⁺-ATPase活性会逐渐下降；pH=3.0和2.5处理组质膜Ca²⁺-ATPase活性虽高于胁迫期但仍低于CK，这可能是因为在恢复期，高强度AR组Ca²⁺浓度增加虽能调节Ca²⁺依赖性蛋白磷酸酶(文彬等，2004)，进而催化ATP酶发生磷酸化和去磷酸化作用，使Ca²⁺-ATPase活性有所上升，但恢复能力有限，受AR强度的制约.

1)胁迫期，pH=5.5和5.0的AR对水稻幼苗的伤害效果不明显，未引起各指标数据发生显著变化.pH=4.0和3.5处理组的Ca²⁺可以通过调控H⁺-ATPase活性降低胞内H⁺浓度，Ca²⁺-ATPase活性受到反馈调节转运多余Ca²⁺，以此增强水稻抗AR能力.pH=3.0和2.5处理组水稻的生理生化功能受到胞内Ca²⁺浓度降低的影响，质膜H⁺-ATPase活性受抑制，水稻抗AR胁迫能力下降.

2)恢复期，质膜H⁺-ATPase活性的恢复与Ca²⁺有关，恢复效果受AR强度影响.Ca²⁺通过调节质膜H⁺-ATPase活性使其恢复到CK的处理水平可以应答pH≥3.5的AR胁迫.但pH=3.0和2.5处理组Ca²⁺的调控能力受限，质膜H⁺-ATPase活性得到部分恢复.

3)由本文结果可知，在高强度酸雨(pH≤3.0)胁迫下，也许可以通过添加外源Ca²⁺来弥补胞内Ca²⁺的缺失，增强水稻抵抗AR胁迫的能力，添加外源Ca²⁺的效果值得进一步探讨.