电离辐射能够诱导机体免疫能力低下，最终诱导肿瘤的发生。造成这种免疫能力低下的主要原因之一就是免疫细胞数量的急剧减少^[1]。树突状免疫细胞(Dendritic Cells, DCs)是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节^[2]。DCs的数量变化往往预示着机体免疫能力的变化，在肿瘤细胞的免疫逃逸研究中占有重要地位^[3]。DCs作为抗原递呈细胞，其数量的减少往往又导致了T细胞、B细胞、NK等抗肿瘤免疫细胞的诱导成熟过程减缓或发生问题^[4]。所以DCs凋亡的研究对于辐射诱导机体免疫能力低下的成因具有重要意义^[5]。但目前辐射诱导DCs凋亡的机制仍不明确。本研究通过利用X射线照射体外分离和培养小鼠骨髓DCs，检测细胞活性、凋亡、抗原递呈能力和抑制肿瘤活性能力的变化，探讨可能的分子机理，为辐射诱导肿瘤细胞免疫逃逸发生提供一定的理论依据，同时为辐射防护提供部分的实验依据。

照射条件：X射线照射采用箱式X射线照射装置(RX-650, FAXITRON, Faxitron Bioptics, LLC, USA)照射体外分离和培养小鼠骨髓DCs，照射剂量为0 Gy、0.5 Gy、1.0 Gy，剂量率为0.5 Gy·min^-1。每组动物数为20只，总共60只，雌雄各半。

清洁级昆明种小鼠（购自甘肃省中医药大学，无特定病原体级实验动物级，SPF级），试验期间自由饮水及采食，动物饲喂高压灭菌颗粒饲料，饮用高压灭菌水，动物许可证号：SYXK（甘）2015-0005。拖颈处死小鼠，无菌状态下取出股骨和胫骨，剪除两端骨骺，用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Solution, PBS)反复冲洗骨髓腔，至骨变白。将所有小鼠的股骨和胫骨收集骨髓腔冲洗液并转移至50mL无菌离心试管中，Tris-NH₄Cl 5 mL裂解红细胞，收集得到骨髓单个核细胞。接种于含10%胎牛血清1640培养基中，加入重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Recombinant Mice Granulocyte Macrophage-colony Stimulating Factor, GM-CSF, 10ng·mL^-1, PeproTech EC)和重组小鼠白细胞介素-4 (Recombinant Mice Interleukin-4, IL-4, 2 ng·mL^-1, PeproTech EC)，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中进行培养。每隔2 d半量换液1次，培养至第7 d。为得到成熟的DCs，加入1 μg·mL^-1脂多糖(Lipopoly-saccharides, LPS) (Sigma-Aldrich)，培养24 h^[6]。

分别于培养第8 d在光镜下观察实验组与对照组细胞形态学的变化。培养第8 d利用流式细胞仪测定小鼠骨髓和DCs CD11c (Biolegend)的表达。用以鉴定DCs^[7]。

细胞照射12 h、24 h、48 h、72 h后，收集培养液于离心管中，用预冷PBS洗涤细胞一次，细胞培养瓶中加入适量不含乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, EDTA)的胰酶消化成熟的DCs，再加入适量含体积分数10%胎牛血清的培养液终止细胞消化，收集细胞到相应离心管中，1500r·min^-1离心，半径为5.5 cm，离心5 min后，弃去上清。计数细胞5×10⁵ mL^-1，用PBS洗涤一次，再离心弃上清。预冷PBS洗细胞一次后，重悬于1×结合缓冲液，其中细胞浓度为1×10⁶ mL^-1，取100 μL细胞悬液（1×10⁵个细胞）在5 mL的离心管内，取5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)试剂加入。避光孵育15 min后，每管加入400 μL结合缓冲液，流式细胞仪1 h内分析。流式细胞仪激发波长为488 nm，用流式光电倍增管检测器-1 (FL1)收集Annexin V-FITC (535 nm)信号，流式光电倍增管检测器-2 (FL2)收集PI (600 nm)信号。每个样本管获取细胞数不少于2×10⁴个，以细胞凋亡百分率表示。

照射后成熟的DCs与小鼠脾脏T细胞（同种异体）或人的非小细胞肺癌A549细胞共培养（小鼠脾脏T细胞纯化利用尼龙柱法）。工作原理：T细胞表面较光滑，容易从尼龙棉上洗脱，而B细胞表面绒毛较多，能较好地吸附在尼龙棉纤维上，分离T细胞的纯度能够达到80%-90%^[8]，DCs与T细胞或与肿瘤细胞共培养5 d后，采用CCK-8方法检测DCs、T细胞和肿瘤细胞活性，用以检测DCs活性和免疫能力的变化^[8]。

利用AG490蛋白抑制剂(Sellect)抑制JAK2/STAT2信号转导通路，AG490溶于二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)，最终作用浓度为60μmol·L^-1（产品说明书推荐浓度），DMSO浓度为0.1%，照射后加入AG490，照射后24 h取样。

照射24 h后，免疫印迹法(Western blot)检测JAK-2、STAT-3和Cleaved Caspase-3的蛋白表达变化。成熟的DCs加入300 μL RIPA裂解液（50mmol·L^-1 Tris (pH 7.4)，150 mmol·L^-1 NaCl，1% Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS，以及2mmol·L^-1焦磷酸钠，25 mmol·L^-1 β-磷酸甘油，1mmol·L^-1 EDTA，1 mmol·L^-1 Na₃VO₄，0.5 μg·mL^-1亮抑酶肽），以超声破碎仪进行组织匀浆。4 ℃ 12000 r·min^-1离心20 min，吸取上清液即为所提蛋白质。蛋白样品利用10%的SDS-PAGE电泳分离并转移到PVDF膜。膜在5%脱脂牛奶4 ℃孵育2 h，之后孵育JAK-2、STAT-3 (Bioworld)、Phospho-Jak2、Phospho-Stat3和Cleaved Caspase-3 (Cell Signaling Technology)一抗4 ℃过夜。弃去封闭液和一抗，使用洗涤缓冲液(Tris-Buffered Saline and Tween 20, TBST)漂洗滤膜三次，每次15 min。加1×封闭液和辣根过氧化物酶(Hydrogen-peroxide, HRP)标记的二抗（1:1000稀释）。2 h后TBST洗膜3次，每次15min。使用增强化学发光法(Enhanced Chemiluminecence, ECL)系统显色及成像。分析方法：结果以β-actin为内参照，用Image J凝胶定量分析软件进行总灰度值的半定量分析。

计量资料采用x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件分析。组间两两比较，采用t检验。p＜0.05表示差异有统计学意义。

于培养第8 d光镜下观察对照组可见伸出突起的DCs。CD11c在绝大多数DCs中高表达，是现有的鉴定小鼠DCs的主要标志物^[8]，培养第8 d筛选的DCs表面CD11c表达比较骨髓细胞增加（图 1(b)）。

图 1

图 1 DCs形态学图(a)和DCs CD11c分子表达(b) Figure 1 Cell morphology of DCs in control (a) and CD11c expression in bone marrow and DCs (b)

将(AnnexinV+FITC)+/PI+（晚期凋亡细胞，Q2）与(AnnexinV-FITC+)（早期凋亡细胞，Q1）的和作为细胞凋亡的指标。与对照组比较，1 Gy X射线照射后的DCs凋亡比例显著升高，流式细胞仪检测结果显示（图 2(a)），DCs在1 Gy X射线照射后12 h凋亡率为5.2%，24 h的凋亡率为35.6%，48 h的凋亡率为25.1%，72 h为4.6%。数据表明，X射线照射后24 h出现DCs凋亡峰值，所以选取24 h作为时间点，研究辐射诱导的细胞凋亡涉及一系列的信号转导通路。0.5 Gy X射线照射后24 h凋亡比例达到19.7%，说明0.5 Gy X射线照射24 h后就能够诱导小鼠骨髓DCs发生凋亡，导致DCs数量显著减少。

图 2

图 2 X射线照射诱导小鼠骨髓DCs凋亡比例增加 (a) 1 Gy X射线照射细胞后12 h、24 h、48 h、72 h后细胞凋亡比例变化，(b) 0.5 Gy和1 Gy X射线照射24 h后DCs凋亡变化*** p＜0.001与对照组比较 Figure 2 Apoptosis of bone marrow dendritic cells induced by X-ray (a) Cellular apoptosis at 12 h, 24 h, 48 h or 72 h after 1 Gy X-ray irradiated, (b) DCs apoptosis at 24 h after 0.5 Gy or 1 Gy X-ray irradiation *** p < 0.001 vs. Control

如图 3所示，小鼠骨髓DCs和脾脏T细胞的活性随着X射线照射剂量的增加而减弱(p＜0.001)，但是肿瘤细胞A549的活性随着照射剂量增加而显著增加(p＜0.05)，实验结果表明，X射线辐射诱导DCs活性、抗原递呈和抑制肿瘤细胞活性能力下降。

图 3

图 3 X射线辐射对于小鼠骨髓DCs活性和免疫能力的影响 * p＜0.05，** p＜0.01和*** p＜0.001与对照组比较 Figure 3 Effect of X-ray on bone marrow DCs activity and immunity ability * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 vs. Control

Western blot结果显示（图 4），X射线辐射能够诱导DCs JAK2、STAT3和Cleaved Caspase-3蛋白表达升高。与对照对比，经过1 Gy X射线照射后，JAK2的蛋白表达增加了3.9倍，磷酸化程度增加了2.5倍，STAT3增加2.7倍，磷酸化程度增加了1.5倍，Cleaved Caspase-3增加7倍。加入AG490抑制剂后，p-JAK2 (p＜0.001)、p-STAT3 (p＜0.01)和Cleaved Caspase-3 (p＜0.5)的蛋白表达显著降低，实验结果表明X射线辐射诱导DCs凋亡可能与JAK2/STAT2/Caspase-3信号转导通路相关。

图 4

图 4 DCs蛋白表达变化 (a) X射线照射后DCs蛋白的表达变化，(b)加了JAK2抑制剂后，JAK2/STAT3磷酸化程度的变化 Figure 4 Changes of protein expression in DCs (a) The expression of protein in DCs after X-ray irradiation, (b) The level of phosphorylation of JAK2/STAT3 inhibited by AG490

DCs是最重要的抗原递呈细胞，目前关于紫外线辐射对于DCs的研究较多，但是关于电离辐射对DCs的影响的研究还较少。本研究表明，0.5 Gy X射线辐射就能够诱导DCs凋亡比例显著增加，从而导致DCs的数量减少和活性降低。而DCs数量和活性的减少往往会使启动MHC-Ⅰ类限制性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Lymphocyte, CTL)反应和MHC-Ⅱ类限制性的CD4+Thl反应发生问题。同时，低数量和活性的DCs还不能通过其高表达的共刺激分子（CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等）提供T细胞活化所必须的第二信号，使启动免疫应答发生故障。更为严重的是，低数量和低活性的DCs不能与T细胞很好地结合，分泌IL-12、IL-18较少，不能激活T细胞增殖，不能诱导CTL生成，使Th1型免疫应答反应发生问题，不利于肿瘤清除。总之，DCs数量的减少和活性的降低，会导致机体免疫能力低下，进而导致一系列诸如肿瘤等疾病的发生和发展^[9]。

电离辐射能够诱导细胞凋亡。由辐射诱发的细胞凋亡是一个极为复杂的生物学过程，涉及基因活化、转录、蛋白修饰、酶的激活及离子浓度改变等诸多因素。多数人认为，辐射诱导的细胞凋亡性死亡由基因控制，从凋亡信号转入细胞内到凋亡相关基因启动以至最后细胞死亡有一个较长的过程^[10-11]。JAKs/STATs信号途径通过配体和细胞表面的受体结合而诱导受体二聚化，二聚化的受体相互磷酸化^[12-13]，进入细胞核，同表达基因的启动子结合，调节基因的表达^[14-15]。结合本研究结果，X射线辐射能够诱导蛋白表达，激活的JAK磷酸化受体，同时磷酸化STAT，诱导STAT3蛋白表达。结果表明，JAK2/STAT3信号转导通路可能能够激活Caspase-3蛋白活性，说明激活JAK2/STAT3通路可能是X射线诱导DCs凋亡的细胞信号转导通路之一。虽然其电离辐射激活Caspase-3蛋白活性表达诱导细胞凋亡还受其他信号通路的影响，但激活JAK2/STAT3/Caspase-3通路极有可能是其诱导细胞凋亡的机制之一，其他信号转导通路还需更进一步的深入研究。本研究结果为辐射诱导肿瘤细胞免疫逃逸发生提供一定的理论依据，同时为辐射防护提供部分的实验依据。