2. 中国科学院烟台海岸带研究所 烟台 264003;
3. 兰州大学 核科学与技术学院 兰州 730000
2. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China;
3. The School of Nuclear Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
随着空间技术和核技术应用日渐广泛，核设施或高能粒子产生的电离辐射对多个领域的从业人员都可能造成不同程度的损伤，如航空航天工作者、医务工作者、军事人员及相关技术工作人员。自由基学说是放射性氧化损伤的基础，当机体受到辐射时，占机体干重80%的水受辐射作用可以产生大量自由基，不断攻击机体从而造成机体损伤[1-2]，因此对辐射损伤的防治与抗氧化作用相关，然而目前临床有效的辐射防护剂较少，且多为化学合成物质，副作用大，寻找天然抗辐射剂是亟待解决的问题。藻蓝蛋白(Phycocyanin, PC)是一种存在于蓝藻中的色素蛋白，有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性，且安全无毒性[3]，其重要的作用机制为消除自由基，减轻氧化应激反应，发挥其药理活性[4]，但藻蓝蛋白运用于动物辐射保护及机制的研究鲜有报道，基于藻胆蛋白的特性，本文以血浆及肝组织作为研究对象，对藻蓝蛋白用于辐射引起的小鼠氧化损伤的预防和治疗作用进行研究。
1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器供试动物：6-8周龄SPF级C57 BL/6雄性小鼠72只，由济南鹏悦实验动物繁育有限公司（动物许可证号：SCXK(鲁)2014-007），体重匀为(20±2) g。
材料与试剂：藻蓝蛋白购自福清市新大泽螺旋藻有限公司；肝脏中抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase, GSH-PX)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；三氯甲烷、无水乙醇、冰醋酸(100%)等所有化学试剂均为分析纯。
主要仪器与设备：X射线采用美国Faxitron RX-650X射线生物辐照器；Tecan Infinite F200/M200多功能酶标仪；CU420型电热恒温水箱。
1.2 实验方法 1.2.1 实验动物与分组6-8周龄SPF级C57 BL/6雄性小鼠72只，普通饲料进行饲喂并自由进食、饮水，适应性喂养7 d，按体重随机分为4组：Ⅰ组为正常对照组、Ⅱ组为单纯辐射组、Ⅲ组为PC预防组、Ⅳ组为阳性对照组。除正常对照组外，采用X射线造模，6 Gy全身单次照射，剂量率143 cGy·min-1，辐射剂量参照Mansour、李程程、李园园等[5-7]研究；PC预防组在辐射前一周至辐射当日灌胃PC (200 mg·kg-1·d-1)预防辐射损伤，用药剂量参照Zheng、Xia等[8-9]研究，阿米福汀作为阳性药，购自南京绿叶制药有限公司，在辐射前半小时腹腔注射[10]，在辐射后1 d、3 d、7 d[11]，每组各取6只小鼠，称重后将小鼠处死，眼球取血滴入经1%肝素钠处理的采血管中，并摘取肝组织。采集的全血迅速以4 ℃、3000r·min-1离心10 min，取上清液待用；留取的组织一部分直接进行组织均浆，1:9加入4 ℃生理盐水，均浆机进行均浆，以4 ℃、3500 r·min-1离心10 min，取上清液进行生化指标检测；另一部分进行冰冻切片，用于超氧化物阴离子荧光探针(Dihydroethidium, DHE)染色，检测活性氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)水平。
1.2.2 血浆中SOD、MDA水平检测采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric Acid, TBA)法检测血浆中MDA含量，采用黄嘌呤氧化酶法检测血浆中SOD的活力，具体操作方法按南京建成公司提供的说明书进行操作。
1.2.3 肝组织中SOD、GSH-PX、MDA水平将组织解冻后，取部分组织称取其重量，按质量(g):体积(mL)=1:9加入4 ℃生理盐水，均浆机进行均浆，以4 ℃、3500 r·min-1离心10 min，取上清液进行生化指标检测。所有操作按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书操作。
1.2.4 肝组织ROS测定肝组织及肺组织中ROS用DHE染色进行检测[12]，将辐射后7 d各组新鲜组织进行冰冻切片，厚度为7 μm，用DHE染色，组织冰冻切片上滴加浓度为5 μmol·L-1的DHE，并在37 ℃避光条件下孵育30 min，DHE可被氧化成溴化乙锭，溴化乙锭可以与RNA或者DNA结合，产生红色荧光，红色荧光采用OLYMPUS DP72荧光显微镜观察并拍照，并用Image-Pro Plus 5.0进行荧光强度分析。
1.3 数据处理数据用x±SD表示，采用SPSS19.0软件进行数据统计分析，采用ANOVA进行组间比较，两两比较采用LSD-t检验。p < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 血浆中SOD活性及MDA含量血浆中SOD活性如表 1所示，经过辐照后小鼠血浆中SOD活性较正常组都有显著的下降(p < 0.05)，说明辐射对小鼠氧化系统造成了损伤，在辐射后1 d，PC预防组和阳性对照组小鼠的血浆中SOD活性明显高于模型组，这提示PC对辐射氧化损伤起到一定防护作用，随着时间的延长，辐射后各组的SOD活性下降，但使用药物组别的小鼠SOD活性下降的幅度小于模型组。如表 1所示，辐射后1 d，相比正常对照组，其他组血浆中MDA明显提高(p < 0.05)，第3 d和第7 d模型组MDA含量持续升高，而PC预防组及各阳性对照组逐渐降低，这说明PC可以抑制MDA的产生。
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表 1 PC对X射线辐射小鼠血浆中SOD和MDA含量的影响 Table 1 Influence of PC on mouse plasma SOD activity and MDA content after X-ray radiation. |
如表 2所示，模型组肝组织中抗氧化酶SOD和GSH-PX较正常组活性显著下降(p < 0.01)，MDA含量明显上升(p < 0.01)，而PC预防及阳性对照组，抗氧化酶活性呈上升趋势，MDA含量虽然随时间延长而上升，但上升幅度小于模型组。
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表 2 PC对X射线辐射小鼠肝组织中SOD、GSH-PX、MDA含量的影响 Table 2 Influence of PC on mouse plasma SOD, GSH-PX activity and MDA content after X-ray radiation. |
图 1是辐射后7 d各组肝组织ROS荧光染色的图片。根据实验原理可知，平均荧光强度越强说明细胞内ROS越多，用Image-Pro Plus 5.0进行荧光强度分析，正常对照组、辐射对照组、PC预防组、阳性对照组的平均荧光强度分别为：0.69±0.02、7.89±0.27、1.88±0.11、1.12±0.056。模型组小鼠肝部染色后的荧光强度显著高于正常组，这提示辐射后以肝部为代表，各组织产生大量ROS，而PC预防组小鼠ROS染色的平均荧光强度虽然较正常组显著提高，但低于模型组，说明PC有一定的清除ROS的能力。
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图 1 辐射后7 d肝组织ROS荧光染色图 (a)正常对照组，(b)单纯辐射组，(c) PC预防组，(d)阳性对照组 Figure 1 ROS staining of liver tissue 7 days after irradiation. (a) Normal control group, (b) Radiation model group, (c) PC pretreatment group, (d) Positive control group |
现代较为普遍的观点认为，电离辐射对正常组织的损伤主要由于射线与组织相互作用后产生的大量ROS对生物大分子造成损伤。大量的自由基不仅可作用于生物膜引起生物膜的脂质过氧化，造成生物膜中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸比例失衡，进而使生物膜功能发生改变，也可能攻击DNA分子中的碱基、核糖及磷酸二酯键，造成碱基氧化、链断裂、与蛋白质交联等多种类型的DNA损伤，并且可能造成蛋白质结构改变，从而影响基因表达及信号转导，最终导致疾病和衰老[13-16]。现有很多报道证明通过减轻机体氧化应激水平，提高抗氧化能力，可减轻辐射损伤[17-18]。实验中对各组小鼠肝组织的ROS水平进行检测，结果表明，辐射模型组小鼠肝中ROS水平较正常组显著升高，而藻蓝蛋白预防组的小鼠较模型组则明显下降，这表明藻蓝蛋白可直接消除ROS，或通过提高过氧化物酶来消除ROS。MDA是膜脂质过氧化的终产物，具有较强的细胞毒性，可使细胞代谢异常，损伤细胞功能，因此观察MDA的含量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出机体的辐射损伤程度[19]。本研究中，血浆中和肝组织中模型组MDA浓度较正常组显著提高，而藻蓝蛋白预防组浓度较模型组显著降低，这提示辐射后小鼠发生脂质过氧化的情况，而在辐射前或者辐射后都可较好地预防或者避免这种情况的发生。
辐射后ROS和MDA的大量产生会对机体造成损伤，而藻蓝蛋白预防组和藻蓝蛋白治疗组可以在一定程度上消除ROS，减少MDA含量，可能是其可以提高抗氧化酶活性，提高抗氧化能力，维持抗氧化系统的正常工作。SOD是一类重要抗氧化酶，对机体的氧化与抗氧化系统平衡起到重要作用，其含量与机体的抗氧化能力呈正相关。GSH-PX是一种广泛存在与机体内的过氧化物分解酶，其含量与机体清除自由基的能力呈正相关，并可避免细胞膜结构和功能遭受过氧化物的损害。因此对SOD及GSH-PX的检测可以反映出机体抗氧化能力。在本实验中，小鼠经X射线辐射后，与正常对照组相比，模型组血浆及肝组织中的MDA显著增加，而血浆、肝组织中SOD、GSH-PX含量显著降低，这些指标提示辐射破坏了抗氧化酶系统，造成机体的氧化损伤。藻蓝蛋白预防组的小鼠MDA较模型组有所降低，而抗氧化酶升高，说明藻蓝蛋白可以抑制脂质过氧化反应，增加机体抗氧化能力，有效地减少组织的辐射造成的过氧化损伤。
就此实验结果看，辐射前服用藻蓝蛋白可对机体的抗氧化系统进行保护，提高抗氧化能力，有效清除机体中过多的ROS和减少MDA含量，但藻蓝蛋白对辐射造成氧化损伤的保护作用的机制有待进一步的探索，经过深入的研究、开发，藻蓝蛋白有望成为良好的辐射保护剂。
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