2. 中国科学院上海应用物理研究所 物理生物学研究室 嘉定园区 上海 201800;
3. 中国科学院大学 北京 100049
2. Division of Physical Biology, Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences, Jiading Campus, Shanghai 201800, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
原子力显微术 (Atomic force microscopy, AFM) 自1986年发明以来[1]，已经广泛应用于各类样品的形貌表征[2-3]和力学性质的测量[4-5]。其中，AFM的力曲线阵列模式 (Force volume mapping, FV)[6]是测量不同材料力学性能（形变量、杨氏模量、粘滞力等）有效的检测方法。FV模式的特点在于原子力显微镜的探针在接触样品过程中，探针悬臂部分的偏折与探针末端与样品间的相互作用力相关。一束激光投射在探针悬臂的背面，光电二极管记录激光的偏折信息，由此可获得探针与样品表面的力曲线，通过分析力-距离曲线得到样品的纳米力学性质。由于FV模式采用的是触发式，成像速度较慢，探针在样品上的作用力精准控制比较困难。由轻敲成像模式发展而来的力学成像模式-峰值力定量纳米力学模式 (Peak Force quantitative nanomechanical mapping, PF-QNM)[7]以峰值力作为反馈信号，而峰值力为设定的探针与样品间极小的相互作用力，所以该模式可准确控制探针作用在样品上的作用力，具有高速和高分辨率测量样品纳米力学性质的特点，可快速扫描样品，同时获得样品的形貌和力学性质信息，为精确测量生物膜[8]、蛋白质[9]和淀粉样纤维[10]等纳米级生物分子结构和力学性质提供了一条重要途径。
脱氧核糖核酸 (Deoxyribonucleic acid, DNA) 是重要的生物分子，承载着生物体的遗传信息，控制着生命体的活动。DNA分子是一种直径只有2.0 nm的长链状生物分子，它是由两条反向平行的DNA链盘旋而成的规则双螺旋立体结构[11]。由于其具备了独特的多样性、特异性和化学稳定性等特性，已经成为人们广泛研究的主题[12]。但是，尽管经历了许多年的研究，DNA分子的一些基本性质仍然没有被很好地理解，例如DNA分子的柔性或弹性等力学性质。在拥挤的细胞核环境中，DNA分子不可避免与液体或生物大分子相互碰撞，被动发生形变；DNA发挥作用时，需要发生构象变化进而与其他分子发生相互作用，这些都与DNA分子的力学性质密切相关[13]。杨氏模量是力学性能研究中最常用的参数之一，虽然已经有AFM测量单个DNA分子杨氏模量的方法[14]，但是液体环境中DNA弹性测量未见报道。DNA分子弹性与自身以及周围环境水分子的含量有密切的关系，在液体环境下的DNA分子其弹性性质更加接近其结构的真实状态。实际上，DNA主要存在于细胞核中，且细胞核中DNA分子多是以超级结构“集合体”的形式存在，DNA双链以线状舒张状态存在的形式很少或者说并不多见。所以，本文以一种DNA自组装形式的DNA折纸为模型，测量DNA分子的杨氏模量，研究其弹性性质。DNA折纸术是由一条DNA长链和若干条DNA短链自组装形成的纳米结构，通过设计可获得形态各异的两维和三维的纳米图案[15]。通常两维的单层DNA折纸是由双链DNA交互排列而成，其理论高度为2 nm，此即为双链DNA分子高度，能够较好体现DNA链规则双螺旋的本质特性。但是如何在测量弹性的过程中，保证针尖有足够的压入深度同时又能够避免基底表面作用力的影响[16]，准确高效地测量DNA的力学性质，依旧是一个值得探讨的问题。
本文利用AFM的PF-QNM模式，测量DNA样品弹性，研究峰值力对DNA折纸杨氏模量测量的影响，并与FV模式相比较，优化DNA折纸杨氏模量的测量方法。
1 材料与方法二维矩形图案的DNA折纸通常是一条长链和两百多条短链自组装形成[17]，本实验所用长方形DNA折纸的自组装步骤简述如下：将长链DNA（单链脚手架链）与216条订书钉链DNA混合于TAE-Mg2+缓冲体系中，放入新加坡生产的PCR (Polymerase Chain Reaction) 仪中，从95 C退火至20 C，退火速率为0.1 C/10 s，获得DNA折纸后进行超滤。长链DNA为美国NEB公司的M13mp18噬菌体病毒单链DNA，订书钉短链DNA购于上海生物工程有限公司。用1×TAE/Mg2+缓冲液（40mmol·L-1 Tris-乙酸、1 mmol·L-1乙二胺四乙酸 (EDTA)、12.5mmol·L-1 MgCl2，pH 8.0），将超滤完成后的DNA折纸稀释到10 nmol，-20 C储存备用。制备AFM样品时，取2 µL的DNA折纸滴于新解离的云母上，吸附5 min后，将样品放在载物台上，加入30 µL 1×TAE/Mg2+缓冲液后，用于AFM成像。
AFM采用的是德国Bruker公司NanoScope Ⅷ系统，在PF-QNM和FV模式下获取数据。扫描管为J头，探针采用Bruker公司型号为Scanasyst-FLUID+的针尖。成像温度为25 C左右。液相环境条件下，在Bruker公司提供的蓝宝石上校准探针偏折灵敏度，用AFM系统自带软件Thermal Tune功能确定探针的弹性常数 (k)，使用布鲁克 (Bruker) 公司提供的已知杨氏模量的标准样品校准针尖的半径 (R)。我们采用PF-QNM的直接法获得样品的弹性模量。
2 实验结果与讨论 2.1 PF-QNM力曲线分析和杨氏模量计算PF-QNM力曲线是力学成像模式获得杨氏模量的原理基础，图 1是PF-QNM的力-距离曲线，横坐标表示探针与样品间的距离，纵坐标表示探针与样品间的作用力，正方向表示峰值力的大小，负方向表示粘滞力，图 1中Extend曲线表示探针靠近样品表面时力和距离的关系，Retract曲线表示探针离开样品表面时力与距离的关系。为了避免趋近曲线中样品塑形形变部分的影响，采用Retract曲线获取样品的弹性形变。利用这部分弹性形变与力的关系，拟合这部分数据，定量计算样品的杨氏模量[18]。
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图 1 力曲线示意图 Figure 1 Sketch of force-distance curve. |
杨氏模量的计算，选择合适的物理模型对力曲线数据进行拟合是首要关键步骤。因为实验条件的不同和样品材料的多样性和特殊性，需要考虑探针接触样品表面时的各种相互作用的差异（主要是粘滞力[19]），可以将探针与样品之间的接触物理模型分为Hertz模型、Sneddon模型、Johnson-Kendall-Roberts (JKR) 模型和Derjaguin-Mrjagui-Toporov (DMT) 模型。Hertz和Sneddon模型是两种本质上相同的模式，它们是不考虑接触面间的相互作用，以针尖-样品之间的相互作用为线性弹性关系。原始Hertz模型仅适用于半球状针尖，后来Sneddon模型对其进行了扩展，将其它轴对称几何形状（圆锥）的针尖也包含在内，丰富了探针形状的选择。JKR模型适用于针尖和样品之间除了有弹性相互作用之外，还有较强的粘合接触。DMT模型适用于粘附力较弱但仍可测到的样品，以及和与样品压痕深度相比针尖半径相对较小的样品最为有效[20]。在动态扫描过程中，样品与探针之间的粘滞力很小[21]，涉及相对较弱的粘附力和较小的针尖半径，因此DMT模型更适用于DNA弹性研究。其公式如下：
| $ F - {F_{{\rm{adh}}}} = \frac{4}{3}{E^*}\sqrt {R \cdot d} $ | (1) |
式中：F是AFM施加的负载力；Fadh是样品的粘滞力；R是针尖半径；d是样品的形变量；E*是简约杨氏模量。其中E*可以由式 (2) 得到：
| $ {E^*}{\rm{ = }}{\left( {\frac{{1{\rm{ - }}\upsilon _{\rm{s}}^{\rm{2}}}}{{{E_{\rm{s}}}}} + \frac{{1{\rm{ - }}\upsilon _{\rm{t}}^{\rm{2}}}}{{{E_{\rm{t}}}}}} \right)^{ - 1}} $ | (2) |
式中：
在AFM的PF-QNM模式下，不仅可以获得样品的高分辨率形貌图，还可以获得包含样品力学性质的信息。图 2(a)和(c)分别为DNA折纸的形貌图和DMT杨氏模量图（峰值力100 pN）。AFM形貌图中（图 2(a)），DNA折纸和云母衬底差别明显。DNA折纸呈现为长方形，横线处高度测量值约为1.9 nm（图 2(b)），与设计的几何形状相符合。杨氏模量图中（图 2(c)）可以观察到两部分弹性杨氏模量，一部分为较硬的白云母，另一部分为DNA折纸，质地较软。横线处模量约为10.0 MPa（图 2(d)）。杨氏模量图中（图 2(c)和(d)），虽然云母和DNA折纸可很好地区分，但是测量获得的云母基底杨氏模量在70 MPa左右，与云母的实际值不符。造成这个现象的原因可能是100 pN的小力对较硬的云母不能达到足够的压入深度[20]。当AFM测量样品的杨氏模量，AFM的探针是否压入样品足够的深度，是非常重要的物理信息。要保证足够的压入深度，除了选择合适的探针外，在PF-QNM模式下也需要选取合适大小的峰值力。图 2(e)是图 2(a)在快速扫描过程中的云母和DNA折纸的力曲线（图 2(e)为DNA折纸上某点的力曲线）。
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图 2 原子力显微镜形貌图像 (a) 和高度信息图 (b)、DMT杨氏模量图像 (c) 和信息图 (d)、DNA折纸的力-距离曲线图 (e) Figure 2 AFM topography image (a) and cross section profile (b), AFM DMT modulus image (c) and cross section profile (d), force-distance curve of DNA origami (e). |
PF-QNM模式能精确控制峰值力大小，同时获得弹性杨氏模量的图像，使获得样品模量值的过程更加快速便捷。对于只有2 nm高度的DNA折纸生物样品，在测量过程中，探针压入的深度对于DNA折纸杨氏模量的测量具有非常大的影响[22]。所以，选取合适的峰值力对测试小分子生物样品的弹性杨氏模量至关重要。也就是说，我们要准确定量测量DNA的弹性杨氏模量，寻找到合适力区间是非常重要的。
为了寻找测量DNA弹性的最佳峰值力，测量中对同一DNA折纸样品，改变峰值力大小，观察DNA折纸的DMT杨氏模量变化趋势。统计结果表明（图 3(a)），当设定的峰值力为60-100 pN时，DNA折纸的杨氏模量变化不大。当峰值力增大到140pN时，DNA折纸的弹性杨氏模量的测量值显著增加，可达到20.0 MPa左右，而峰值力降低到40 pN时，DNA折纸的弹性显著减小。从力-距离曲线中，可以获得样品在受到不同力作用下的形变。当AFM峰值力较小在40 pN时，DNA的弹性杨氏模量显著减小。这可能由于峰值力太小，造成探针压入DNA折纸深度不够，如图 3(b)中第一种探针与样品压入位置深度关系所示；当峰值力在140pN时，由于力过大，导致探针压入形变受到基底云母的影响，造成实际的DNA模量值被掩埋，如图 3(b)中第三种情形。当峰值力在80-100 pN时，探针压入DNA折纸深度相对合适，如图 3(b)中第二种情况，结合模量值与峰值力关系，可得出该力区间所测的DNA杨氏模量值较为准确，并且稳定性好。
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图 3 不同峰值力DNA折纸的弹性杨氏模量 (a) 和三种针尖压入折纸深度的示意图 (b) Figure 3 The DMT modulus of DNA origami as a function of peak force (a) and sketch of the three kinds of indentation of tip pressuring on DNA origami (b). |
传统的FV模式广泛应用于生物、医学和材料等领域，在FV模式下得到的力曲线更能反映样品真实的物理特性[23]。
图 4(a)是FV模式形貌图，图 4(b)是图 4(a)中黑色叉处的力曲线，即探针作用白云母的力-距离曲线，图 4(c)是图 4(a)中折纸处的力-距离曲线，即探针作用在DNA折纸的力-距离曲线。在图 4(b)中，Extend曲线表示探针靠近白云母表面时力与距离的关系曲线，Retract曲线表示探针离开白云母表面时力与距离的关系曲线。比较图 4(b)和图 4(c)中的Retract曲线，并进行DMT杨氏模量的拟合，图 4(b)中，Retract曲线部分线性好，反映的是白云母的弹性杨氏模量，拟合值为4.5 GPa；图 4(c)中的折纸的Retract曲线可以观察到斜率不一样的曲线，可大致分为两部分：Ⅰ区和Ⅱ区。曲线Ⅰ区的对应拟合的力区间在100-400 pN，形变量在0.5 nm，根据DMT拟合的弹性杨氏模量是450MPa。在这部分力区间内，所测得杨氏模量明显高于Ⅱ区部分。而在曲线Ⅱ区的对应拟合的力区间是0-100pN，形变量在1.2nm，拟合的弹性杨氏模量为10.0 MPa左右。综合DNA折纸的特点，高度为2.0nm。可以认为，Ⅱ区的弹性杨氏模量就是DNA折纸的杨氏模量，Ⅰ区部分的力曲线是固体基底白云母和DNA折纸共同作用的结果。而且通过观察多条DNA折纸上的力曲线，此现象比较明显，并非偶然现象。图 4(d)中分别为400 pN和720pN作用力条件下的力曲线，发现在100pN以下区间拟合杨氏模量在10.0 MPa左右，400 pN力曲线拟合数据为10.3 MPa，720 pN力曲线拟合数据为8.9 MPa。说明在不同的力作用下，拟合力曲线中力为0-100 pN，可以得到DNA折纸的弹性模量约为10 MPa。以上结果显示，尽管两种力学测量模式成像有些差异，但在一定范围内获得的DNA折纸的力学测量数据相近似。
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图 4 FV原子力显微镜形貌图像 (a)、白云母表面上的力-距离曲线 (b)、DNA折纸的力-距离曲线 (c)、DNA折纸分别受到400 pN和720 pN条件下，探针离开DNA折纸表面时的力曲线 (d) Figure 4 FV topography AFM image (a), force-distance curve of mica (b), force-distance curve of DNA origami (c), retract curves of DNA origami under the force of 400 pN and 720 pN, respectively (d). |
DNA是重要的长链状生物分子，其弹性与结构和功能密切相关。本文将AFM的力学性质测量与DNA折纸技术相结合，建立了一种新颖可靠的定量测量DNA分子杨氏模量的方法。通过AFM的PF-QNM模式，获得了液体环境中DNA折纸的杨氏模量，发现当峰值力区间为80-100 pN时，测量结果较为准确和稳定。AFM的PF-QNM模式与传统的力学性质测量模式FV相比较显示两种力学性质测量模式各有特点。对于DNA折纸来说，只有在合适的针尖与样品相互作用力范围内，获得的杨氏模量才比较可靠。本文测量的DNA折纸的杨氏模量约为10 MPa，随着样品与探针间的作用力有所改变，说明生物材料有较大的弹性、易形变，提示在对微小的生物薄样品进行定量力学性质测定时，需要控制作用力的范围，这对其他生物分子弹性测量具有借鉴的意义。
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