丁醇是一种重要的C4 平台化合物，广泛地应 用于各种精细化学品的制造，并作为继乙醇之后另 一种极具发展前景的新一代液体燃料，已被联合国 国际能源署列为第二代生物燃料^{[1, 2, 3]}。由于生物丁醇 具有能量密度高、腐蚀性小、安全性好等优点^[4]， 使其作为生物燃料的生产前景十分诱人。因此，生 物法制备丁醇倍受各国的关注。目前，实验室和工业生产中使用的产丁醇菌种类型主要可分为4 种类 型：Clostridium acetobutylicum、C. beijerickii、C. saccharoacetobutylicum 及C. saccharoperbutylacetonicum[ 5]。然而，工业化发酵制备生物丁醇还存在诸 多问题，如原料成本高（红薯、糖蜜等淀粉质和糖 质原料）、丁醇产率低等缺点导致其生产成本高、市 场竞争力弱^[4]。木质纤维素原料是一种价格低廉、 来源丰富的可再生资源^[6]，因此，如何高效利用木 质纤维素资源制备燃料丁醇是一个具有重大意义的 研究方向。

植物生物质是可用于制备液体运输燃料的可持 续资源^[7]，而充分利用这类资源的关键障碍是缺乏 可靠的经济与技术支持。与以石油为原料制备运输 燃料相比，利用植物生物质为原料制备液态燃料的 生产规模小、生产成本高。植物生物质资源是自然 界中非常丰富且廉价的资源，具有很大的应用潜力 和市场。美国能源部调查表明，截止2030 年，美国 可用于工业化生产的生物质原料将达11～16 亿t。 其中，森林生物质原料占有1.60～6.64 亿t，价格约 为60 美元/t，最低价格为40 美元/t；与此同时，农 业残留物和废物约占有4.04 亿t，每吨的价格约为 60 美元^[8]。我国是农业大国，每年约产8 亿t 农作 物秸秆，相当于4 亿t 标准煤^[9]。由此可见，利用生 物质原料制备生物燃料已成为必然的趋势，也成为 生物质能源发展战略的重要组成部分。

木质纤维素中的纤维素被层层半纤维素覆盖， 并且木质素和半纤维素的紧密复合结构也包裹着纤 维素，相互之间又以共价键结合^[10]。因此，其结构 不易降解，必须经过预处理手段（物理法、化学法、 生物法）将木质素和半纤维素分解，并达到破坏纤 维素晶体结构的目的，利于后续纤维素的酶解过程， 使其分解为单糖，也用于发酵生产。

预处理方法主要包括碱处理、稀酸水解（0.1%～ 3%硫酸）、SPORL（1%～8%亚硫酸盐和0.5%～2% 的硫酸）、蒸汽爆破、氨爆破及生物法等方法^[11]：碱 预处理后很难除去无机盐及铵根离子，所以碱处理 法很少受到关注^{[11, 12]}，石灰是一种便宜的碱资源， 但石灰预处理面临大规模应用的难题^[13]；酸法预处 理需要在高温(150～200℃)、高压下进行^[14]，操作 条件较苛刻，低固液比要求在发酵前必须进行酸的 中和及无机盐的去除，操作繁琐，腐蚀问题也是稀 酸水解的另一个严重缺陷，而且酸解过程形成的粘 性木质素沉淀在反应器壁和管道中不利于后续清 理^[8]，目前还没有解决此问题经济有效的方法；蒸 汽爆破、氨爆破属于物理化学法，主要通过高压蒸 汽使纤维发生一定的机械断裂，同时高温高压破坏 纤维内部氢键，从而改变纤维的物理化学性质；生 物法是利用分解木质素的一些微生物除去木质素， 解除其对纤维素的包裹作用，该方法耗能低、不污 染环境，但周期长、处理效率低。

表1 列出一些木质纤维素的预处理方法，除了 上述方法外，还包括亚硫酸盐法以及使用在AVAP 生物精炼过程中的SEW（SO2/乙醇/H2O）分解方法。 SEW 方法反应条件较低，只需要130～150℃及2～ 3 L/kg 的固液比，并且在分馏液中不存在碱性金属 离子(Mg、Na)，只需要蒸发除去乙醇和SO2。这些 优点使得SEW 处理成为从木质纤维原料中释放糖 分并用于发酵的一种独特的方法。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 木质纤维素预处理方法的比较[8]

表1 木质纤维素预处理方法的比较[8]

木质纤维素经过预处理后，释放的纤维素需进 行纤维素酶水解为单糖用于发酵生产。水解过程需 要葡聚糖内切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)、β-葡萄 糖苷酶3 种酶。其中EG 即内切纤维素酶，作用于 较长的纤维素链，主要产物是纤维糊精，不能单独 作用于结晶纤维素；CBH 即外切纤维素酶，从纤维 素的还原端或非还原端依次切下，生成纤维二糖；β- 葡萄糖苷酶用来水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生 成单糖葡萄糖。

木质纤维原料经预处理及酶解后，会生成了一 定量的发酵副产物，主要包括有机酸、醛类、酚类 等化合物。与乙醇发酵不同，产丁醇菌(C. beijerinckii) 不受糠醛、HFM（羟甲基糠醛）及乙酸的抑制，相 反，这些物质在较低浓度时可以被菌体代谢利用， 促进菌体的发酵。因为发酵培养基中的酵母膏会将 这些物质转化成NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）， 从而降低甘油的生成量，提高丁醇的产量^{[15, 16]}。而 C. acetobutylicum 易受甲酸、木质素及半纤维素的降 解产物（丁香醛、阿魏酸、香豆酸及一些硫酸盐类） 的抑制^{[17, 18]}。甲酸是木质纤维素水解糖液中的副产 物，当甲酸浓度超过0.5 g·L^-1 时就可严重抑制C. acetobutylicum 的生长^[19]。Wang 等人发现甲酸浓度 在细胞内浓度为1 mM 或46 ppm 时，细胞的生长就 受到严重的抑制，因为ABE（丙酮-丁醇-乙醇）发 酵时的pH 为5，而甲酸的pKa 值为3.8，使胞内H+ 浓度增加，破坏了细胞膜电位，而细胞要消耗 ATP(三磷酸腺苷)来维持原细胞电位，使得细胞内用 于代谢的ATP 供应不足，导致细胞代谢缓慢，严重 时死亡^[20]。当阿魏酸和对香豆酸的质量浓度在0.3 g·L^-1 时，也会强烈抑制C. beijerinckii BA101 的生长 与发酵。酚类物质对C. acetobutylicum 的抑制作用 最严重，一般认为，酚类化合物可提高细胞膜的流 动性，造成细胞膜破裂，最终使细胞死亡。因此， 木质纤维素预处理糖液的脱毒对丁醇发酵起着至关 重要的作用。目前脱毒方法主要包括电渗析、石灰 澄清法、阴阳离子交换法和活性炭法^{[18, 21, 22, 23]}。预处 理液的脱毒过程往往需要多种方法相结合，取长补 短综合利用，才可有效去除对丁醇发酵有害的有毒 副产物。

丁醇发酵具有悠久的发展历史，Pasteur 最早报 道了利用微生物发酵法生产丁醇，1914 年著名的 Weizmann 博士成功分离得到一株丙酮丁醇菌，其生 产性能有了很大的提高，这为ABE 发酵的工业化奠 定了基础。近年来，通过生物信息学以及发酵性能 等方面的研究和分析认为，工业产溶剂梭菌归为4 种，即C. acetobutylicum、C. beijerinckii、C. saccharobutylicum 和C. saccharoperbutylacetonicum^[5]。

传统的丙酮丁醇梭菌发酵生产中的丁醇终浓度 维持在13 ～ 14 g·L^-1 左右，生产效率低于0.3 g·L^-1·h-1。以玉米原料为例，总溶剂产率一般只有 30%左右，低的溶剂产率进一步降低了原料的利用 率，进而提高了原料成本。因此，为了降低原料成 本，研究者们寻找一些廉价的木质纤维资源作为原 料生产丁醇。Qureshi 等以小麦和大麦秸秆、玉米秸 秆等的水解液作为碳源，利用C. beijerinckii P260 进行ABE 厌氧发酵，小麦秸秆进行稀酸预处理和酶 水解后得到60 g·L^-1 的糖液，经过滤、超滤后用C. beijerinckii P260 进行丁醇发酵，总溶剂质量浓度为 25.0 g·L^-1，其中丁醇产量为12.0 g·L^-1，丁醇得率为 48%。但以未经任何脱毒处理的大麦秸秆、玉米秸 秆水解液中的糖分作为原料发酵时，菌株生长则受 到严重的抑制^[23]。同样，Thaddeus Ezeji 等分别以 XAD-4 resin 方式脱毒的玉米芯酸解和酶解糖液为 底物发酵，利用突变株C. beijerinckii BA101 发酵制 备丁醇，总溶剂产量为9.30 g·L^-1，其中丁醇浓度为 6.4 g·L^-1，丁醇得率为69%。但是未经脱毒的玉米芯 预处理糖液对突变株BA101 的生长和产溶剂能力产 生严重的抑制，原因是该菌株耐毒性差，不能利用 未脱毒的酸解糖液发酵生产丁醇^[24]。Soni 等也发现 C. saccharoperbutylacetonicum 的生长与发酵会受到 甘蔗渣和水稻秸秆水解液的强烈抑制^[25]。由此可见， 产丁醇菌可利用木质纤维原料制备丁醇，但是其耐 受性差是导致以木质纤维素原料生产丁醇时低产率 的关键因素。因此，选育高抗逆性产丁醇菌株对以 木质纤维素为原料制备丁醇具有重要的意义，是实 现原料成本低、生产效率高的最佳突破口，也是最 迫切需要解决的问题。

目前主要采用传统的诱变方法筛选丁醇新菌 株，如紫外线诱变、化学诱变、粒子束诱变等。上 海植物生理研究所通过化学诱变的方法得到一株高 产丁醇的菌株C. acetobutylicum EA2018，发酵产溶 剂比为丁醇：丙酮：乙醇 = 7：2：1，在百吨发酵 罐实验中得到的丁醇比例为71.9%，比原始菌株提 高10%左右^[26]。Annous^[27]等用亚硝基胍做诱变剂， 以葡萄糖的类似物2-脱氧葡萄糖作为抗代谢阻遏物，筛选得到高产丁醇的菌株C. beijerinckii BA101。 郭亭等通过粒子束诱变育种得到C. beijerinckii IB4，该突变株对酚类化合物具有较高的耐受性，能 够以含总酚浓度为1.4 g·L^-1 的未脱毒的玉米芯酸解 糖液作为碳源进行发酵，总溶剂产量可达9.5 g·L^-1， 丁醇产量达6.8 g·L^-1 ，丁醇占总溶剂比例为 71.6%^[28]。杜腾飞等通过响应面法优化P2 发酵培养 基，以C. beijerinckii IB4 进行发酵，可产丁醇9.5 g·L^-1，比未优化的发酵结果提高近40%^[29]。同时， 研究发现，当玉米芯或甘蔗渣酸解糖液中的酚类化 合物的浓度提高到1.5 g·L^-1 以上时，C. beijerinckii IB4 基本不生长，因此，在此基础上结合进化代谢 技术，进一步筛选出一株对于6 种模式酚类物质具 有最强抗逆性的突变株C. beijerinckii M7，该突变 株以玉米芯酸解糖液进行分批发酵时，总酚浓度为 1.9 g·L^-1，其总溶剂和丁醇产量分别可达10.8 g·L^-1 和7.7 g·L^-1，丁醇所占总溶剂比例为71.3%^[30]。另 外，中国专利201410086648.5 通过常温等离子体诱 变筛选获得一株高耐受性拜氏梭菌C. beijerinckii M17，在酚浓度高达2.0 g·L^-1 的发酵液中，仍能非 常好地发酵生产丁醇，其总溶剂产量和丁醇产量分 别达到了10.9 g·L^-1 和7.9 g·L^-1，丁醇合成比例为 72.5%。甚至当酚浓度高达2.4 g·L^-1，菌体也可较好 地生长，并具有可观的产溶剂能力，其总溶剂产量 和丁醇产量为8.7 g·L^-1 和5.9 g·L^-1。表2 列举了一些 以木质纤维素为原料的产丁醇菌株的现状。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 以木质纤维素为原料生产丁醇的生产菌株研究现状

表2 以木质纤维素为原料生产丁醇的生产菌株研究现状

随着科研工作者对产丁醇梭菌深入的研究，C. acetobutylicum ATCC824 和C. beijerinckii NCIMB8052 的基因组测序已经顺利完成^{[35, 36]}，发现 一些基因能够提高其对毒素物质的抗逆性，并开展 了基因工程育种的研究。Tomas 等在丙酮丁醇梭菌 中过量表达编码热激蛋白的groESL 基因，使丁醇对 菌体细胞的抑制作用降低了85%，最终使产物浓度 提高了33%^[37]。Jang 等通过敲除负责酸生成的酶编 码基因，构建的基因工程梭菌C. acetobutylicum 以葡萄糖作为碳源进行分批发酵时，丁醇产量为18.9 g·L^-1，丁醇得率达0.71（mol 丁醇/mol 葡萄糖），比 野生菌分别高出160%和245%^{[38, 39]}。

另外，由于产丁醇梭菌对毒素物质的本底抗逆 性低、丁醇耐受性低，科研工作者开始寻找其他微 生物如大肠杆菌、酵母菌等非梭菌作为产丁醇的宿 主菌株。例如大肠杆菌构造相对简单，遗传背景清 晰，因此常常被作为基因工程对象加以使用。然而， 大肠杆菌缺乏对丁醇的自然耐受性，因此Zhou 等将 产溶剂梭菌Clostridium 中的基因thil、adhe2 和bcs 操纵子(crt、bcd、etfB、etfA 和hbd)在大肠杆菌中 表达，成功构建基因工程菌株E. coli MG1655 (DE3)，丁醇产量为18.5 mg/L，再经导入GlpF 基因、 敲除副产物合成路径，丁醇产量可达97.9 mg/L^[40]， 提高效果显著。酵母菌也是一种具有比较完备的基 因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力的单 细胞真核生物，也是当前工业乙醇的生产菌株。 Maryam Karimi 等研究了在酵母启动子TEF1 和 PGK1 的调节下同时过量表达生物合成基因hbd、 crt、ter 和adhE，使得丁醇浓度从7.5 g·L^-1 提高到 26.8 mg·L^{-1 [41]}。

发酵是典型的两阶段发酵，分为产酸期和产溶 剂期^{[1, 42, 43]}。在产酸期，主要产物为乙酸、丁酸、 H2 和CO2，有机酸的产生导致pH 下降；当其积累 到一定程度，发酵进入产溶剂期，会将产生的乙酸 和丁酸转变为主产物丙酮、丁醇和乙醇。

Hubert 等研究发现，当pH 调控在6.0 时，以不 同流速添加葡萄糖连续培养丙酮丁醇梭菌DSM173 的主要产物为丁酸和乙酸，当pH 降到5.2～4.3 时 才生成丙酮和丁醇^[44]；丙酮丁醇梭菌B18 的发酵pH 调控在6.0 时，葡萄糖的消耗速率为4.37 g·L^-1·h-1， 丁醇的生成速率为1.0 g·L^-1·h-1，而丙酮丁醇梭菌B1 能够在相同的pH 条件下进行高速生长、高效发 酵^[45]。Godin 等利用丙酮丁醇梭菌ATCC 824 在P2 培养基进行发酵，第一阶段将pH 维持在4.5，葡萄 糖补料速率0.08 h-1，第二阶段将pH 维持在4.5~5.0， 补料速率0.04 h-1（补料速率即稀释速率：单位时间 流加入发酵罐内的新鲜培养液与发酵体系培养液体 积的比值），使得总溶剂达到了21 g·L^-1，糖转化率 达到0.36 g/g^[46]。因此，发酵不同阶段采用不同的 pH 调控策略，可提高丁醇的生产效率。

底物浓度超过一定量时会对丙酮丁醇梭菌产生 抑制作用，因此，为避免过高浓度底物对菌体的毒 害作用，可采用补料分批发酵工艺，使发酵体系中 的底物浓度维持在较低浓度，减少底物对菌体生长 与发酵的抑制作用，使菌体在较高速率下生长，从 而合成更多的产物丁醇。Qureshi 等采用补料分批发 酵工艺使反应器的生产速率和ABE 质量浓度分别 达到了0.98 g·L^-1·h-1 和165 g·L^-1·h-1，而分批发酵只 达到了0.39 g·L^-1·h-1 和25.3 g·L^{-1 [47]}。

发酵液中的产物丁醇积累到一定量时也会对产 丁醇菌株产生抑制，因此，目前广泛应用气提和渗 透汽化技术，移去发酵体系中的丁醇，降低其对发 酵的抑制，从而有效地提高丁醇的产量及效率。

Ezeji 等人^[48]将气提分离工艺用于丁醇发酵，与 间歇发酵相比，该工艺使溶剂产率和产量分别提高 200%和118%；以H2 和CO2 为载气，采用半连续发 酵和气提产物回收耦联的工艺，发酵201 h，溶剂产 率提高400%，总溶剂产量可以达到232.8 g·L^-1。 由此可见，气提应用于发酵-分离耦合体系不但可以 避免丁醇的产物抑制作用，也可大大提高ABE 的产 量及产率，降低发酵-分离耦合工艺的成本，但是其 性能受到发酵的操作方式、载气速率、底物种类等 因素的影响。此外，Qureshi 等人^[47]将渗透汽化分离 与补料分批发酵技术耦合，补料葡萄糖浓度达到500 g·L^-1，渗透液中的溶剂浓度达到165.1 g·L^-1，与间歇 发酵相比，ABE 产率从0.35 g·L^-1·h-1 提高到0.98 g·L^-1·h-1。渗透汽化-发酵的耦合工艺不仅可有效提高 发酵产率，也是一种清洁、无污染的新型分离技术， 然而其分离性能及通量很大程度上取决于膜本身特 性，在一定程度上限制了其使用。

未来以糖为原料的极具有开发潜力的生物燃料 丁醇必然越来越受到关注，但其高成本、低产率仍 然是制约丁醇大规模工业化发展的重要障碍。木质 纤维素生物质是一种价格低廉、来源丰富的可再生 资源，利用其作为原料是丁醇的未来发展趋势。然 而，由于产丁醇菌株对木质纤维原料预处理液有毒 物质的耐受性差，导致丁醇产率低，间接提高了成本。因此，从目前主流产丁醇菌种的发酵情况可以 看出，要提高木质纤维原料制备丁醇的经济性和竞 争力，使丁醇发酵适应现代工业的要求，主要需从 以下方面考虑：探索木质纤维素原料转化成可利用 糖的新的方法，实现木质纤维原料的高效绿色转化； 利用基因工程、代谢工程相结合的手段改造菌种， 构建并筛选对水解液毒性物质具有高抗逆性的高产 丁醇的新型菌种，提高丁醇的发酵效率；优化发酵 过程，使菌株在发酵体系中保持较高的生产能力。