右旋糖酐（又称葡聚糖）是以葡萄糖单体形成 的聚合多糖，分子量由数万到数百万，其粘性随分 子量增大而增大。制糖中出现的右旋糖酐是由肠膜 明串珠菌分泌的右旋糖酐蔗糖酶催化合成产生^[1]， 它主要存在于砍收后甘蔗、火烧蔗、病虫害甘蔗和 压榨后的蔗汁中。右旋糖酐产生速度很快，在气温 比较高、生产卫生环境比较差的条件下，情况尤为 严重。国内研究人员作过调查发现：人工收割后的 新鲜甘蔗在自然条件下存放24 h后，初压汁中右旋 糖酐含量达到95.4 mg/kg°Bx，48 h 后达到150.3 mg/kg°Bx。机械收割甘蔗24 h 后右旋糖酐含量为 246.6 mg/kg°Bx，48 h后达到400 mg/kg°Bx 以上。 蔗汁中右旋糖酐可以每小时38%～44%的速度增长^[2]。右旋糖酐的产生通常还伴随着蔗汁变酸变坏， 因为右旋糖酐蔗糖酶催化作用将蔗糖分子结构一半 的葡萄糖分子聚合形成右旋糖酐，而剩余的另一半 果糖分子随后被分解成有机酸^[3]。右旋糖酐的存在 会对制糖生产造成不良后果，如蔗糖损失^[4]、旋光 度虚假升高^[5]、粘度增大、过滤性降低、影响沉降 速度和清净效率、降低传热效能、延长蒸发煮糖时 间、增加能耗、影响结晶^[6]、影响产品的适用性等。

制糖生产中，主要通过提高甘蔗质量、重视生 产车间环境卫生以及使用一定量的杀菌剂，抑制肠 膜明串珠菌等微生物的生长繁殖，以减少甘蔗或蔗 汁中的右旋糖酐含量。但实际上很难做到完全避免 制糖原料中右旋糖酐的存在，尤其在榨季后期。除 去糖液中右旋糖酐最有效的方法是在制糖生产中加 入一定量的右旋糖酐酶，将右旋糖酐水解成小分子 量的寡糖或者葡萄糖单体，可有效地降低右旋糖酐 对制糖生产和产品质量的不良影响^{[7, 8, 9]}。目前国内相 关研究主要应用外国生产的右旋糖酐酶，但是进口 的右旋糖酐酶价格较昂贵。本试验应用本研究室自 主研发生产的右旋糖酐酶进行除去蔗汁中右旋糖酐 的试验，探索其最佳条件，为其在制糖生产的应用 提供科学数据。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器

甘蔗汁：广州甘蔗糖业研究所；右旋糖酐酶： 广州甘蔗糖业研究所；标准右旋糖酐：美国法玛西 亚公司；右旋糖酐单克隆抗体免疫比浊检测试剂盒： 广州甘蔗糖业研究所；氢氧化钠，盐酸为分析纯。

MCA-SucroseTM浊度计（配套四面透光型1 cm 的一次性塑料测试皿）：美国Midland公司；pH测 定仪：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；自动 阿贝折射仪：上海精密科学仪器有限责任公司； DK-S24型电热恒温水浴箱：上海精宏实验设备有限 公司；AL104电子分析天平：美国Mettler公司。 1.2 检测方法

右旋糖酐酶酶活测定：DNS法^[10]；蔗汁右旋糖 酐含量测定：免疫比浊法^{[11, 12]}。 1.3 实验方法 1.3.1 原料预处理及酶活测定

取新鲜蔗汁，接入少量肠膜明串珠菌，在自然 条件下放置并不定时采样测定其右旋糖酐含量，待 含量达到800～900 mg/kg°Bx（对锤度）时用于实验， 取右旋糖酐酶发酵液准确测定其酶活，并适当稀释， 置于4℃冷藏，并于当天实验使用。 1.3.2单因素试验 1.3.2.1 pH值

取800 mL蔗汁，测定其右旋糖酐含量，再平 均分装到100 mL锥形瓶中，用NaOH或HCl溶液 分别将pH值调到4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、 8.0，每个样品加入1 mL右旋糖酐酶稀释液（加入 量为0.1 U/mL蔗汁），置于60℃水浴中搅拌10 min， 迅速取出加热煮沸灭活2 min，冷却至室温后分别测 定各组样品的右旋糖酐含量。 1.3.2.2 温度

取5个编号的锥形瓶，分别装入100 mL蔗汁， 测定其右旋糖酐含量，再用NaOH或HCl溶液将pH 值调至6.0，然后分别都加入1 mL右旋糖酐酶稀释 液（加入量为0.1 U/mL蔗汁），分别置于40、45、 50、55、60℃（温度控制±1℃）的水浴中搅拌10 min， 之后操作与1.3.2.1同。 1.3.2.3 反应时间

取6个编号的锥形瓶，分别装入100 mL蔗汁， 测定其右旋糖酐含量，再用NaOH或HCl溶液将pH 值调至6.0，然后分别都加入1 mL右旋糖酐酶稀释 液（加入量为0.1 U/mL蔗汁），分别置于60℃水浴 中搅拌5、10、15、20、25、30 min，之后操作与 1.3.2.1同。 1.3.2.4 物料浓度

各取100 mL蔗汁用精糖将其锤度分别调成15、 20、25、30、35、40、45、50、55、60 °Bx（浓度 控制±1 °Bx）的蔗汁，测定其右旋糖酐含量，再用 NaOH或HCl溶液将pH值调至6.0，然后分别都加 入1 mL右旋糖酐酶稀释液（加入量为0.1 U/mL蔗 汁），再置于60℃水浴中搅拌10 min，之后操作与 1.3.2.1同。 1.3.2.5 酶剂量

取不同右旋糖酐含量的蔗汁（100±50、300±50、 500±50、700±50、900±50、1100±50、1300±50 mg/kg°Bx）各500 mL，准确测定其右旋糖酐含量， 再用NaOH或HCl溶液将pH值调至6.0，再分别将 每个右旋糖酐含量梯度的蔗汁分到5个编号锥形瓶 中，每个编号分别加入右旋糖酐酶稀释液0.2、0.5、 1.0、1.5、2.0 mL（酶加入量分别是0.02、0.05、0.1、 0.15、0.2 U/mL蔗汁），再置于60℃水浴中搅拌10 min，迅速取出加热煮沸灭活2 min，冷却至室温后 分别测定各组样品的右旋糖酐含量。 1.3.3 响应曲面优化试验

响应面法（RSM）是采用多元二次回归方程作 为函数估计的工具，将实验中多因素与指标的相互 关系用多项式近似拟合，依此可对函数的响应值进 行分析，研究因子与目标函数之间因子与因子之间 的相互关系^[13]。在单因素对右旋糖酐酶水解右旋糖 酐效果基础上，通过响应曲面法对右旋糖酐酶除去 蔗汁中右旋糖酐的效果进行优化，得到右旋糖酐酶 应用于制糖生产除去蔗汁中右旋糖酐的最佳工艺条 件。响应面分析因素与水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 Box-Behnken试验设计因素编码及水平

表1 Box-Behnken试验设计因素编码及水平

其影响见图1。从图1可知，在加酶量为0.1 U/mL蔗汁、反应温度为60℃、反应时间为10 min 条件下，随着pH升高，蔗汁中右旋糖酐的去除率 先升后降：当pH为5.5～6.0时，右旋糖酐的去除 率最高达到80%以上；此后随着pH升高，右旋糖 酐去除效果逐渐降低；当pH大于7.0时，酶的作用 效果急剧下降。说明右旋糖酐酶在pH为5.5～6.0 的条件下酶的活性最高，该条件与制糖生产过程中 的初压汁、预灰之前混合的pH范围一致。

图1(Figure 1)

图1 pH对右旋糖酐酶降解右旋糖酐效果的影响

其影响见图2。结合制糖生产中混合汁及渗浸 稀汁的温度条件，将试验温度范围设计在40～60℃ 之间。从图2可知：在温度为40～55℃范围，随着 温度的升高，右旋糖酐酶的作用效果越来越好，对 蔗汁中右旋糖酐去除率也随之增大，但增加幅度不 显著，去除率从40℃的75.89%提高到55℃的 82.00%；60℃比较55℃右旋糖酐去除率稍有下降。 实验表明在30℃～60℃之间该右旋糖酐酶的稳定性 良好，随着温度的升高酶蛋白的活化分子增加，酶 促反应加快，右旋糖酐去除率随之增加，但当温度 升高到酶蛋白的热变性点时，酶活性开始下降^[14]。 温度在40～60℃范围内，该酶均保持较高活性，对 蔗汁中右旋糖酐去除率达到75%以上。

图2(Figure 2)

图2 温度对右旋糖酐酶降解右旋糖酐效果的影响

其影响见图3。从图3看出，在0～5 min范围 内，随着反应时间的增加，右旋糖酐去除率显著增 大，5 min时去除率达到76.35%，反应时间大于5 min 后去除率没有明显增大。酶是一种高效催化剂，在 反应中未被消耗，理论上，随着反应时间的增加， 右旋糖酐的去除率也逐渐增加，但实验结果显示并 非如此，说明在60℃的条件下作用5 min后使该α 右旋糖酐酶活性有所下降。

图3(Figure 3)

图3 反应时间对右旋糖酐酶降解右旋糖酐效果的影响

其影响见图4。从图4可知：在蔗汁浓度为15～ 35 °Bx范围内，蔗汁浓度的增大对右旋糖酐酶催化 水解右旋糖酐没有明显影响；当蔗汁浓度大于35 ゜Bx，随着浓度的增大，酶促反应速率逐渐下降； 达到65 °Bx时，右旋糖酐的去除率只有34.73%。其 原因可能是在浓度小于35 °Bx时，传质效果良好， 酶与底物接触充分；当蔗汁浓度大于35 °Bx时，随 着浓度增加、粘度增大，酶与底物不能有效充分接 触，或活化水减少使酶促反应下降^[15]。

图4(Figure 4)

图4 物料锤度对右旋糖酐酶降解右旋糖酐效果的影响

其影响见图5。从图5可以看出：在反应温度 为60℃、反应时间为10 min的相同条件下，当蔗汁 中右旋糖酐含量只有89 mg/kg°Bx时，添加酶剂量 为0.02 U/mL对蔗汁，右旋糖酐去除率达100%；当 蔗汁中右旋糖酐含量为494 mg/kg°Bx时，添加酶剂 量为0.02 U/mL对蔗汁，去除率37.25%；当加酶量 为0.05 U/mL对蔗汁可去除全部右旋糖酐；当蔗汁 右旋糖酐达到870～1508 mg/kg°Bx时，添加0.05 U/mL对蔗汁的酶剂量，亦可去除80%以上右旋糖 酐；当加酶量增加到0.1 U/mL对蔗汁时，可全部除 去蔗汁中的右旋糖酐。

图5(Figure 5)

图5 酶剂量对右旋糖酐酶降解右旋糖酐效果的影响

根据Box Benhnken的中心组合试验设计原理， 综合单因素试验影响结果，选择酶剂量(A)、酶解 pH(B)、酶解反应时间(C)和酶解反应温度(D)4 个因 素，进行3水平响应面分析试验，利用Design Expert 软件试验数据进行二次多元回归拟合，得到右旋糖 酐酶作用的效果模型，即蔗汁中右旋糖酐去除率与 自变量A、B、C、D 的二次回归方程： R1=97.35+11.73A+0.34B+4.74C-34.69D-1.63AB-2.14 AC+2.57AD-2.01BC+0.91BD-0.027CD-3.11A²-9.40B²-1.513C²-42.98D²。

方差分析及显著性检验结果见表2、表3。结 果 表明：该回归模型极显著（P<0.0001），其决定系数 为R²=0.9759，Pred R²=0.8611，说明该模型预测性 良好；变异系数C.V<10%，表明实验数据的变异性 程度小。因此可以用该模型分析和预测右旋糖酐酶 水解蔗汁中右旋糖酐的效果。此外，一次项A、D 以及二次项A²、D²对右旋糖酐酶作用效果影响极显 著；一次项C和二次项B²对右旋糖酐酶作用效果影 响显著；交互项均不显著，说明各因素之间相互作 用不明显。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 回归方程方差分析

表2 回归方程方差分析

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 模型的可信度分析

表3 模型的可信度分析

图6为响应面立体分析图及等高线图。通过观 察可以直观地反应A、B、C、D各因素对响应面值 的影响，如图6所示。从图6-1、6-2和6-3可知： 随着酶剂量的增加，酶解作用效果越来越明显，对 蔗汁中右旋糖酐的去除率越高，可观察到立体图向 酶剂量增加方向上扬趋势；当酶剂量一定时，随着 酶解pH值的增加，酶解作用对右旋糖酐去除率先 增大后减小，在pH 5.5处达到最高；随着酶解反应 时间的增加，右旋糖酐去除率也随之增加，但是超 过13 min后变化趋势很微弱，原因可能是反应13 min后酶活有较大损失；随着酶解反应温度的增加， 右旋糖酐去除率先增大后减小，在53℃达到最大； 从图6-4、6-5和6-6可以看出：酶解pH值固定时， 右旋糖酐去除率随时间的增加而增加、随着温度的 增加先增加后降低，在53℃处达到最高；当酶解反 应温度一定时，随着酶解pH增大右旋糖酐去除率 先增大后减小，在pH5.5达到最大，去除率随着反 应时间的增加而增加。从响应面立体图可看出，右 旋糖酐去除率对酶剂量(A) 及酶解反应温度(D)2 个 因素较敏感，曲面较陡；酶解反应时间和酶解pH 代表的曲面比较平缓，说明在4.5～6.5pH范围内， 该右旋糖酐酶较稳定且催化活性较高，5 min酶解反 应可分解大部分右旋糖酐。

图6(Figure 6)

图6 响应面立体分析图及等高线图

通过软件分析出右旋糖酐酶水解蔗汁中右旋糖 酐的最佳工艺条件：酶剂量为0.05 U/mL蔗汁，pH 为5.31，反应时间为14.94 min，反应温度为：51.35 ℃。根据优化条件进行验证试验，将条件选为：酶 剂量为0.05 U/mL蔗汁，pH为5.3，反应时间为15 min，反应温度为51℃，蔗汁右旋糖酐含量为859 mg/kg。试验结果表明，5组平行试验中4组样品酶 解反应后检测不出右旋糖酐，1 组测出7.21 mg/kg°Bx，所以在该优化条件下，右旋糖酐酶可以 很有效地除去蔗汁中右旋糖酐。 3 结论

通过单因素实验探讨了右旋糖酐酶剂量、酶解 pH、酶解反应时间、酶解反应温度和物料浓度对应 用右旋糖酐酶水解蔗汁中右旋糖酐效果的影响，并 在此基础上采用响应面法试验设计建立主要因素对 酶解作用效果影响的预测模型，确定了最佳工艺条 件：酶剂量为0.05 U/mL蔗汁，pH为5.3，反应时 间为15 min，反应温度为51℃，在此条件下可将蔗 汁中859 mg/kg°Bx的右旋糖酐除去。该工艺条件适 合在制糖生产压榨工段应用右旋糖酐酶，除去混合 汁中存在的右旋糖酐，为进一步研究右旋糖酐酶在 制糖工业上应用提供参考。