2013
2 广西糖业研发中心, 广西南宁 530002
2 Guangxi Sugarcane Industry R&D Center, Nanning 530002
随着国内外糖品市场竞争的激烈化及品质意识 的提升，越来越多的人意识到糖料甘蔗品质对制糖 效率、成本以及产品质量的影响。制糖工业中通常 以一些利于高糖分收回的因素作为甘蔗品质评定的 指标，蔗糖分高、纯度高、纤维素含量低、非糖分 少的甘蔗被公认是品质好的甘蔗[1]。这种衡量标准 适用于新鲜、完整的甘蔗评定，但对于评定受微生 物感染而变质的甘蔗来说并不完善。糖料甘蔗在采 收后由于微生物感染会产生新陈代谢产物如有机 酸、乙醇、甘蔗葡聚糖、低聚糖、甘露醇等。在南 非，乙醇的积聚曾被作为甘蔗提取中糖分损失的指标以及由火烧收割到破碎提汁延误的指标，火烧蔗 中的乙醇含量是非火烧蔗中的2～3倍[2]，但后来证 明乙醇不能作为衡量甘蔗变质的有用指标[3]。甘露 醇形成速率远高于协同产生的低聚糖或者乙醇，被 认为是甘蔗变质的一个可靠指标[3,4,5]。但是以上几种 因素所带来的危害远远没有甘蔗葡聚糖的大。
甘蔗由于刀伤、压伤、病虫害等因素形成创口， 在收割后放置期间，创口受到肠膜明串珠菌等微生 物感染而形成葡聚糖。伴随着甘蔗的机械化收割， 蔗料刀口增多，收获、运输、压榨之间协调难度增 加，使甘蔗葡聚糖的形成剧烈地增加，其带来的问 题越来越凸显，所以不能简单地以蔗糖分、纯度等 作为划分甘蔗品质好坏的指标，葡聚糖在甘蔗或者 蔗汁中的含量成为衡量甘蔗品质的新指标。
葡聚糖的实时监测成为甘蔗制糖生产控制的一 个重要技术。葡聚糖的测定一般可用Haze/ICUMSA 法[6]、Robert’s铜法[7]、Potical Activity Ltd. DASA 法[8]、酶解法等。但这些方法都有较大的局限性， 如准确度不高、操作繁琐等缺点。本团队现已成功 制备葡聚糖单克隆抗体，能与葡聚糖形成抗原-抗体 （Ab-Ag）复合物而发生混浊，通过测定溶液浊度 而计算得出葡聚糖含量。该方法准确度高，前处理 简单，5～10 min即可得到结果，适用于甘蔗制糖过 程原料、糖产品及在制品中的葡聚糖检测，可实时 监测糖厂生产过程的葡聚糖含量变化。
α-葡聚糖T-2000标准品，蔗汁及白砂糖样品 若干，葡聚糖单克隆抗体检测试剂盒（广州甘蔗糖 业研究所研制）。
MCA浊度仪，移液枪，手持式锤度计，电子天 平，滤纸。
常规指标的测定按《白砂糖》（GB317-2006） 和《甘蔗制糖化学管理分析方法》进行，葡聚糖含 量测定采用免疫比浊法。
液体样品以0.45 μm滤膜过滤后备用，固体样 品溶解至蔗糖浓度为50 °Bx左右，以0.45 μm滤膜 过滤后备用。
取抗体冻干粉1瓶，加入10 mL抗体稀释液，摇 匀后静置5 min，用0.45 μm滤膜过滤后备用。吸取1 mL抗体，静置2 min，读取浊度值，记为N标0；加 入10 μL葡聚糖标准品（500 mg/L），用移液器吹打 混匀，开始计时，读取2 min时的浊度值，记为N标， 则500 mg/L葡聚糖标准品引起的浊度变化值为（N标 －N标0）。
吸取1 mL抗体，静置2 min，读取浊度值，记 为N0；加入10 μL经过前处理的样品，用移液器吹 打混匀，开始计时，读取2 min时的浊度值，记为 N1，则样品引起的浊度变化值为（N1－No）。
样品中葡聚糖含量（mg/kg）=（N1- N0）×500 ×稀释倍数/（N标- N标0）
在10.0 mL容量瓶中配制浓度为800、600、500、 250、100、50、25、12 mg/Lα-葡聚糖T-2000标准 溶液，以浓度及其对应的吸光度值作图，得标准曲 线并计算回归方程及R2值。灵敏度是分析物浓度或 量的微小变化所产生的分析信号的变化，其实质是 标准曲线的斜率。
以蒸馏水为空白样品，重复测定5、10、20 mg/L 标准品6次，用t 检验统计测定数据与空白相比是 否有显著性差异，确定有显著性差异的最小浓度。
重复测定500 mg/L标品及原糖样品8次，计算 其相对标准偏差(RSD)值。
分别精密称取1.000 g原糖样品，溶于1 mL蒸 馏水中，以0.45 μm膜过滤制得供试品溶液。
分别吸取1.0 mL蔗汁和糖蜜，以12000 r/min 离心5 min，上清液以0.45 μm膜过滤制得供试品溶 液。
根据免疫比浊法平行测定2次的结果，计算得 各供试品溶液α-葡聚糖含量。加入一定量葡聚糖标 品的白砂糖样品，计算空白加标回收率；加入一定量葡聚糖标品的原糖、蔗汁、糖蜜样品，计算样品 加标回收率。计算公式：
由图1分析可知在浓度为500 mg/L以下线性关 系良好，线性回归方程为y=0.0759x+0.7437，相关 系数R2=0.9967，标准曲线的斜率为0.0759 NTU? (mg/L)-1，本试验所用浊度仪精度为0.1 NTU，则引 起仪器读数变化的最小浓度为1.32 mg/L，因此可认 为本方法的灵敏度为1.32 mg/L。浓度为500 mg/L以上时结果偏离线性，原因可能是抗体量不足。本 实验使用500 mg/L 以下线性关系良好部分为标准 曲线。结果见表1及图1。
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表1 葡聚糖T-2000标准曲线 |
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图1 T-2000葡聚糖标准曲线 |
以蒸馏水为空白样品，重复测定5、10、20 mg/L 标准品6次，用t 检验统计测定数据与空白相比是 否有显著性差异，确定有显著性差异的最小浓度为 10 mg/ L。结果见表2。
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表2 免疫比浊法测定葡聚糖标准品的最低检出限?NTU |
重复测定500 mg/L葡聚糖标准品和1份原糖样 品各8次，计算相对标准偏差(RSD)值分别为3.0% 和3.7%。结果见表3。
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表3 免疫比浊法测定葡聚糖标准品及原糖样品的重复性 |
表4为免疫比浊法样品加标回收实验结果。 由表4得，免疫比浊法测定葡聚糖的加标回收 率为98%～102%。
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表4 免疫比浊法的样品加标回收实验 |
甘蔗葡聚糖主要是在甘蔗变质期间形成，是甘 蔗变质的直接产物。葡聚糖的产生和存在均使蔗糖 损失，葡聚糖的产生直接消耗蔗糖，产生的葡聚糖 又明显增大糖液的粘度，降低糖液的过滤性，影响 煮糖、结晶与分蜜。严重时因葡聚糖形成而消耗蔗 糖将导致每10000 t甘蔗直接损失大约7 t蔗糖。因 此，有必要重视甘蔗原料、在制品、成品中葡聚糖 的测定及清除问题，降低生产成本，提高制炼效率、 提高产品品质。
免疫比浊法适用范围广，可用于测定甘蔗中的 葡聚糖来衡量甘蔗的新鲜度，还可用于测定不同制 糖工艺所得的糖产品及在制品，如原糖、白砂糖、 赤砂糖、蔗汁、糖蜜等。该方法有显著性差异的最 小浓度为10 mg/ L，线性范围为10～500 mg/L。超 出500 mg/L后，免疫比浊法所得结果偏离线性回归 线，因此在实际测定中，应将样品稀释至葡聚糖含 量为500 mg/L以下，再进行免疫比浊分析。免疫比 浊法具有样品前处理简单、测定时间短（10 min/样）、 准确度高、测定条件简单的优点。
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