2013
甘 蔗 (Saccharum officinarum) 为 禾 本 科 甘 蔗 属，原产于热带和亚热带地区，是我国最重要的糖 料经济作物之一。甘蔗种植面积占糖料种植面积的 85%以上，产糖量占全国总产糖量的 90%以上。广 西是我国甘蔗种植面积最大之一的省份[1,2]。ROC22 是广西目前种植的当家品种，具有高产高糖、易脱 叶、抗性好的特性，深受蔗农喜欢。然而，甘蔗因 常年连种而使品种退化，导致品质下降，产量降低。 许多学者利用组培快繁技术，已通过以芽增芽、愈 伤组织分化不定芽等途径进行了大量研究，但未曾 对甘蔗胚性细胞团的诱导和增殖的相关因子进行系 统的研究。胚性细胞团在愈伤组织的基础上产生， 具有增殖快、分化率高、成苗率高等优点[3,4]。本 研究以 ROC22 愈伤组织为材料，研究相关因子对 甘蔗胚性细胞团诱导与增殖的效应，为今后进一步 研究甘蔗诱变突变体和遗传转化等提供参考依据。
以甘蔗 ROC22 愈伤组织为供试材料，来自广西大学农学院植物组织培养中心本课题组。
以 MS+NAA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L 为诱导 培养基，分别添加 2,4-D 0 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L，每处理 30 瓶，每瓶 10 粒黄豆大的愈伤组织，重复 3 次，培养 25 天后统 计胚性细胞团诱导率，比较不同浓度 2,4-D 对甘蔗 胚性细胞团诱导的影响。
以 MS+2,4-D 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L 为继 代培养基，添加不同种类和浓度 KT(0.5 mg/L，1.0 mg/L)、 CPPU(0.5 mg/L， 1.0 mg/L)、 TDZ(0.02 mg/L， 0.04 mg/L)，比较不同细胞分裂素对甘蔗胚性细胞 团继代增殖的影响。
以 MS+2,4-D 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L 为继代培养基，比较不同培养日龄(15 天， 25 天，35 天，45 天)的胚性细胞团对继代增殖的影响。
以 MS+2,4-D 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L 为继代培养基，比较不同继代代数(1～10 代)的胚性细胞团继代增殖的差异。
以 MS+2,4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L 为继代培养基，比较不同光照培养方式(全 光照，先光后暗，全暗培养，先暗后光)对甘蔗胚 性细胞团继代增殖的影响。
以上培养基均为附加蔗糖 30 g/L，琼脂 6 g/L， pH 5.8； 培养光强为 1500～1800 lx， 培养温度为 25～ 28℃。
甘蔗胚性细胞团的继代增殖倍数用称重法(鲜 重)比较，在继代接种时和培养 25 天后分别进行。 相关指标的计算公式如下：
胚性细胞团诱导率(%)=发生胚性细胞团块数/ 愈伤组织接种块数×100
胚性细胞团增殖倍数=培养后胚性细胞团重量 (g)/接种时胚性细胞团重量(g)
试验数据用 SPSS 方差分析软件进行统计分析。
从表 1 可以看出，随着 2,4-D 浓度的变化，甘 蔗胚性细胞团的诱导率呈现一定的规律。从处理 A1～A5，即 2,4-D 浓度范围为 0～4.0 mg/L，甘蔗 胚性细胞团的诱导率呈低高低的趋势，每个处理的 诱导率差异均达到极显著水平，说明甘蔗胚性细胞 团诱导受 2,4-D 浓度影响很大，适宜的 2,4-D 浓度 有利于形成胚性细胞团，但 2,4-D 浓度过高则会抑 制。其中，处理 A4，即 2,4-D 浓度为 3.0 mg/L， 对甘蔗胚性细胞团诱导率最高，为 30.33%，由此 说明，2,4-D 浓度为 3.0 mg/L 时，对甘蔗胚性细胞 团的诱导效应最佳。
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表 1 不同 2,4-D 浓度对甘蔗胚性细胞团的诱导效应 |
由表 2 可以看出，不同种类和浓度的细胞分裂 素对甘蔗胚性细胞团的继代增殖影响不同。与对照 (CK)相比，分别添加一定浓度的 KT、CPPU、TDZ 等 3 种细胞分裂素，均可以提高胚性细胞团的增殖 率。其中，添加 KT、TDZ 的处理对胚性细胞团的 增殖效应比 CPPU 的好；以 KT 0.5 mg/L(B5 处理)对甘蔗胚性细胞团继代增殖最好，培养 25 天后其 增殖倍数达 38.80 倍，且与其他处理之间差异达极 显著；其次是 TDZ 0.02 mg/L，胚性细胞团增殖倍 数为 36.11 倍；再次是 KT 1.0 mg/L, 胚性细胞团增 殖倍数为 30.23 倍。由此说明，在继代培养基中添 加适宜浓度的激动素 KT，更有利于甘蔗胚性细胞团 的增殖。
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表 2 不同细胞分裂素种类及浓度对甘蔗胚性细胞团继代增殖的影响 |
从表 3 可以看出，不同培养日龄对甘蔗胚性细 胞团继代增殖的影响不同。在 15～45 天范围内， 随着日龄的增长，胚性细胞团的增殖降低。其中， 培养日龄为 15 天的胚性细胞团(C1 处理)增殖效果 最好，增殖倍数达 42.06 倍，与其他处理之间的差 异性均达极显著；甘蔗胚性细胞团增殖倍数的大小 排序和胚性细胞团质量的优劣排序均为 15 天＞25 天＞35 天＞45 天。试验结果表明，适宜的培养日 龄有利于甘蔗胚性细胞团的继代增殖。
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表 3 不同培养日龄的甘蔗胚性细胞团对继代增殖的影响 |
从表 4 可以看出，不同继代代数对甘蔗胚性细胞团无性系增殖的影响不同。从第 1～10 代，胚性 细胞团增殖倍数呈现低高低的规律。其中，以第 4 代的胚性细胞团(D4 处理)增殖达到最高峰值，增殖 倍数为 44.80 倍，与其他处理之间差异均达极显著。 而到第 10 代的胚性细胞团(D6 处理)增殖降到最低 峰值，增殖倍数仅为 18.67 倍。从胚性细胞团的质量比较来看，以第 1 代至第 4 代的胚性细胞团质量 为好。试验结果表明，适宜的继代代数有利于甘蔗 胚性细胞团的继代增殖，而继代代数过高则不利于 增殖。
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表 4 不同继代代数对甘蔗胚性细胞团无性系增殖的影响 |
由表 5 可以看出，不同光照培养方式对甘蔗胚 性细胞团继代增殖的影响不同。其中，先暗培养再 光照培养对胚性细胞团的增殖效果最佳，增殖倍数 为 35.05 倍，与其他处理之间的差异达到极显著水 平。全光照培养的胚性细胞团增殖最少，增殖倍数 仅为 18.17 倍。对胚性细胞团质量好的比较排序为： 先暗后光＞全暗培养≥先光后暗＞全光照。试验结 果表明，先暗培养再光照培养更有利于甘蔗胚性细 胞团的继代增殖。
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表 5 不同光照培养方式对甘蔗胚性细胞团继代增殖的影响 |
在植物组织培养中，植物激素对愈伤组织和胚 性细胞团的诱导起到关键作用。不同植物种类、不 同诱导材料需要的外源激素种类和浓度均不同。其 中，2,4-D 是诱导甘蔗愈伤组织的不可缺少的重要 因子[5]。本实验在此基础上对甘蔗 ROC22 胚性细 胞团进行诱导，结果发现，未添加生长素 2,4-D 的 培养基不能诱导出胚性细胞团，而添加一定浓度的 2,4-D 则能够诱导出胚性细胞团，并呈现一定的规 律，以 2,4-D 浓度为 3.0 mg/L 较利于甘蔗胚性细胞 团的诱导，这与韩光禧等的研究结果相符[6]。添加 一定浓度的细胞分裂素可以促进柑桔胚性细胞团的 增殖[7]。本研究结果发现，在有 2,4-D 和 NAA 的继 代培养基上，适当添加 KT 和 TDZ 均能显著提高 甘蔗胚性细胞团的增殖效果，其中，以 KT 0.5 mg/L 最佳，胚性细胞团增殖倍数达 38.80 倍。由此证明， 适当的生长素和细胞分裂素配比，更有利于甘蔗胚 性细胞团的诱导和增殖。
胚性细胞团具有很高的繁殖能力和相应的增殖 高峰，如玉米胚性细胞团的增殖高峰一般出现在转 接培养后的 15～20d 内，培养 20 天后增殖降低，25 天后停止增长，开始出现老化[8]。本研究结果表明， 培养 15 天日龄的甘蔗胚性细胞团增殖能力最高， 增殖倍数高达 42.06 倍，而在 15 天日龄以后的胚 性细胞团，其增殖则逐渐下降，这一趋势与前人的 有关研究相似，但甘蔗胚性细胞团增殖高峰和下降 时间出现更早。因此，为防止胚性细胞团老化，应 及时转接到新的培养基上继续培养。植物细胞离体 培养的再生能力与培养的时间长短或代数高低密切 相关。本研究结果发现，甘蔗胚性细胞团的增殖能 力受继代代数影响很大，以第 4 代的继代增殖倍数 最高，高达 44.80 倍，之后的代数则逐渐降低，这 与薛美凤等对棉花的有关研究结果相符[9]。长期的 继代不但降低胚性细胞团的增殖能力和分化能力， 而且还会使胚发生畸形和再生植株不育。因此，甘 蔗胚性细胞团不宜长期的继代；就与初代甘蔗胚性 细胞团继代能力比较而言，一般不宜超过 7～8 代。
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