2012
2. 广西大学轻工与食品工程学院, 广西, 南宁, 530004
2. Insiute of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning Guangxi 530004
随着当今制糖工业技术的进步，制糖副产物糖 蜜的纯度越来越低，糖蜜中含的非发酵性糖分、无 机盐灰分、胶体和有机酸越来越多[1]，其中有机酸 会抑制酵母活性，灰分会导致载体和粗馏塔结垢， 焦糖色素及胶体会吸附在酵母细胞表面从而影响细 胞传质，严重时会引起细胞大片絮凝结团，最终导 致发酵不良、出酒率低等现象[2]。早期传统的 As 2.1189、As 2.1190 等菌种对这种新型的糖蜜显得越 来越不适应，所以驯化糖蜜酿酒酵母以适应低纯度 糖蜜对当今糖蜜酒精工业有重要意义。传统驯化方 法是把糖蜜酿酒酵母逐步接种于糖蜜锤度渐进升高 的发酵培养基中[3]，此种方法是依靠酵母本身的基 因改变自动去适应外界环境因素，过程可想而知是 漫长而无序的， 一般驯化周期是长达一年甚至几年。 本文在此基础之上加上紫外诱变，让酵母基因组发 生人为快速的改变从而定向筛选到适应高锤度的糖 蜜培养基的诱变酵母[4]，此诱变酵母在发酵培养基 中形成集体增殖优势，之后再分离纯化筛选得到诱 变酵母的单菌落。此过程比酵母自动适应要快，效 率要高。本文选育出 2 株较好适应糖蜜的菌株，显 微镜下观察细胞个体形态较原始出发株饱满，发酵 速度有较大提高。
菌种 As 2.1189，由广州甘蔗糖业研究所保存； 糖蜜，由广东徐闻三和发展有限公司提供；驯化培 养基： 34.5゜Bx 糖蜜、 37.5゜Bx 糖蜜， pH3.8， 10 ppm 杀菌剂，0.2%尿素；高糖平板：25゜Bx 糖蜜，pH 自然，0.2%尿素，1.5%琼脂粉；发酵培养基：36゜ Bx 糖蜜，pH4.0，0.2%尿素。
第 1 阶段：取 4.5 mL 驯化液至平皿，20 W 紫 外灯照射 20～25 min， 取 2 mL 诱变液分别接种至 2 瓶 40 mL 的 34.5゜Bx 糖蜜培养基中， 34℃静止培养 24 h，称重，选取失重大者作为下一代诱变出发菌 重复以上步骤，50 代后，失重速率缓慢提升，转入 第 2 阶段。
第 2 阶段：取 4.5 mL 第 1 阶段驯化液至平皿， 20 W 紫外灯照射 25～30 min，取 2 mL 诱变液分别 接种至 2 瓶 40 mL 的 37.5゜Bx 糖蜜培养基中，34 ℃静止培养 24 h，称重，选取失重大者作为下一代 诱变出发菌。重复以上步骤，50 代后，失重速率逐 渐提升，分离筛选单菌落，YPD 斜面保存。
初筛：取第 2 阶段最终诱变驯化液稀释涂布 25 ゜Bx 高糖平板， 每个平板菌落数在 20～30 个为宜， 放置 34℃培养 2 d，每个平板挑选 2 个菌苔边缘圆 整、饱满者做之字划线分离，将划线分离的平板置 于 34℃培养 2 d，继续挑取单菌落再做之字划线分 离，确保分离到纯种，最后挑取单菌落做斜面保藏 并编号。
复筛：将初筛的 10 株菌和初发菌接种于 YPD 活化液培养 16 h，测 OD600，调整至同一 OD 值，按 10%的接种量接种至发酵培养基。测残糖、酒度、 发酵周期。
由于一共有 100 代诱变驯化，数据量繁多，本 文只选取其中 12 代的数据
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表1 川选2003-1的出苗数和出苗率及其与对照的比较 |
从以上数据看出第 1 阶段即 1～50 代，天失重 量阶段性提升，从最初的 2.41 g/d 增加到 2.63 g/d， 失重速率提升了 9.1%，这说明酵母发酵周期缩短， 同等渗透压下酵母发酵能力增强。第 2 阶段即 51～ 100 代，天失重量也是逐渐提升，由 2.12 g/d 上升至 2.32 g/d，天失重增加了 7.6%，但天失重量比第 1 阶段的每代都要少，主要原因是该酵母最高耐受糖 蜜锤度为 34.5゜Bx，如果锤度增加到 37.5゜Bx 以 后会抑制酵母的活力及发酵力。总体来讲，经过 2 个阶段的诱变驯化， 该酵母对 34.5゜Bx 和 37.5゜Bx 糖蜜的耐受能力都较初始出发菌有一定提高，即该 酵母更适应高浓度糖蜜发酵。
经过浓糖发酵实验，从 10 株初筛菌里挑选到 2 株诱变驯化株，分别命名为 B2 和 A17，图 1 为 3 株菌的发酵失重量对比，表 2 为发酵结束时 3 株菌 的产酒度和残糖数据。
图 1 可以看出，A17 比亲株发酵快 8～10 h，发 酵速率提升约 12%，B2 发酵速率提升约 6%，考虑 系统误差，3 株菌的最终发酵失重相当。 由表 2 可以看出驯化诱变株的产酒度相对提升 了 2%～3%（v/v） ，残糖相对亲株降低了 2%～3%。 总而言之，驯化诱变株的发酵速度提升相对较高， 说明诱变筛选株发酵活力更强，高渗透压等胁迫因 素对发酵酶系的抑制减弱。这有利于大生产中提高 设备利用率，增加酒精日产量，降低吨酒精所耗劳 务、折旧等生产成本。
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图 1 亲株和诱变驯化株发酵失重对比 |
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表 2 产酒度和残糖对比 |
图 2 为显微镜放大 640 倍观察亲株和 A17 的细 胞形态。可以看出 A17 个体细胞形态较为饱满偏圆 状，而亲株个体多为椭圆状。有可能是胞内液压增 大导致细胞变圆，相应的表现为 A17 的抗高渗能力 增强。同时也看出，A17 细胞多趋于聚集状而亲株 的细胞则分散均匀。诱变驯化株的这种特性是进一 步研究的重点，这对解决工业大生产中酵母絮凝结 团将会有重大的指导意义。
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图 2 640 倍显微镜观察亲株和 A17 的细胞形态 |
（1）经过 2 个阶段共 100 代的诱变驯化，该酵 母对 34.5゜Bx 和 37.5゜Bx 糖蜜的耐受能力都较初 始出发菌有一定提高，即该酵母更适应高浓度糖蜜 发酵。
（2）筛选到 2 株诱变驯化株，其中 A17 发酵 速率提升约 12%，B2 发酵速率提升约 6%，显微镜 下观察诱变驯化株个体细胞形态较为饱满偏圆状且趋于聚集状。
| [1] | 尚红岩,郭艺山,徐日益,等.糖蜜酒精生产积垢问题探讨[J]. 甘蔗糖业,2012(1):46-50. ( 1)
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| [2] | 尚红岩.甘蔗糖蜜酒精发酵过程酵母凝聚的成因与防治措施[J]. 甘蔗糖业,2005(3):43-51. (1)
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| [3] | 梁秉华,罗家骐.甘蔗糖蜜酒精生产检验方法[M]. 广州:轻工业部甘蔗糖业科学研究所,1986:77. (1)
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| [4] | 梁磊,张远平,黄向阳,等.基于基因组改组技术选育多重抗性乙醇酵母[J]. 现代食品工业,2009,25:1107-1114. (1)
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