2012
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是 近20 年来应用最广泛的真核表达系统之一，已有 500 多种来自细菌、真菌、病毒、动植物和人的蛋 白在该系统得到了成功表达[1,2]。毕赤酵母能够高效 表达外源蛋白，对外源蛋白具有翻译后修饰功能； 宿主本身背景蛋白少，还可通过合适的信号肽，使 产物能够顺利分泌至胞外，易于纯化分离；外源基 因可整合进入酵母基因组被稳定地遗传。然而在毕 赤酵母基因组中却缺少蔗糖酶基因，因此无法利用 蔗糖。甘蔗糖蜜中含有30%以上的蔗糖，这样就限 制了糖蜜作为碳源应用于毕赤酵母的大规模培养。 蔗糖酶（invertase）既能催化蔗糖水解生成葡萄糖和 果糖，也能催化棉子糖水解生成密二糖和果糖，是 酿酒酵母蔗糖代谢途径中的第一个关键酶。酿酒酵 母基因组中编码蔗糖酶的SUC2基因，能够转录形 成1.9kb和1.8kb 2种mRNA，前者的翻译产物被糖 基化并且分泌至胞外，而后者的翻译产物则留在胞 质中，成为胞内酶[3]。
本实验克隆了蔗糖酶基因SUC2。将蔗糖酶基 因整合进入毕赤酵母基因组，得到能够水解利用蔗 糖的毕赤酵母工程菌。该工程菌将能利用糖蜜进行 培养。
酿酒酵母AS2.1190由广州甘蔗糖业研究所保 存。毕赤酵母菌株KM71H、质粒pPICZαA 购自 Invitrogen公司；TransTaq DNA 聚合酶、pEASY-T1 TA克隆载体试剂盒、DNA marker 购自全式金公司； E. coli JM109感受态细胞、限制性内切酶、碱性磷 酸酶（CIAP）、T4 DNA连接酶、菌体裂解液试剂盒 （Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）、质 粒小提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自 Takara公司；Dextran T2000购自Pharmacia公司； 寡核苷酸引物由Invitrogen 公司合成；LLB（低盐 LB培养基）、YPD、YPDS培养基以及YPDS Zeocin 抗性平板均按照Invitrogen 公司的毕赤酵母表达手 册配制。
MJ Mini PCR仪，美国BIO-RAD公司生产； DY-6C核酸电泳仪，北京六一仪器设备有限公司生 产；SKY-200B全温度培养振荡器，上海苏坤实业有 限公司生产；2510电转仪，德国Eppendorf公司生 产。
根据目的基因SUC2的序列，扩增SUC2基因 及其上游的调控区域和下游的转录终止区，设计一 对基因扩增引物：P1（5'-GATCAGATCTTATGAAA GTAGTTCGTCGCAATTTG- 3'）和P2（5'-GATCAG ATCTACATTCGTCACTCGTTGCTAAAGCC- 3'）， 如下划线所示，上下游引物均引入Bgl II酶切位点。
酿酒酵母AS2.1190在YPD培养基中培养48 h 后，离心得到菌体沉淀，参照菌体裂解液试剂盒说 明书，裂解AS2.1190酵母菌体获得基因组后直接进 行PCR扩增，扩增条件为：94℃、5 min（94℃、 30 s；55℃、30 s；72℃、3 min 30 s；共32个循环）； 72℃、10 min。将扩增产物进行TA 克隆，连接 pEASY-T1载体。在含有IPTG和X-gal的氨苄青霉 素抗性平板上进行蓝白斑筛选。选取平板上的白色 克隆，以P1、P2为引物，进行菌落PCR，筛选得 到克隆载体TA-SUC2。
用限制性内切酶BglII 分别对克隆载体 TA-SUC2 和pPICZαA进行酶切，37℃、8 h。酶切产物进行胶回收纯化之后，线性化的载体pPICZαA 经碱性磷酸酶处理，与SUC2基因片段16℃连接过 夜。连接产物转化感受态大肠杆菌，在含25 μg/mL Zeocin的LLB平板上挑选阳性克隆，进行菌落PCR 检测，之后送交测序确认，得到表达载体 pPICZαA-SUC2。
表达载体pPICZαA-SUC2使用Sac I 于37 ℃、 8 h酶切使之线性化。琼脂凝胶电泳检测重组质粒是 否酶切完全，检测后使用DNA纯化试剂盒纯化产 物。线性化质粒（10 μg）与感受态毕赤酵母KM71H （80 μL）混合，电击转化条件为：1500 V、25 μF、 200Ω。毕赤酵母细胞转化之后涂布于YPDS抗性平 板上（含100 μg/mL Zeocin），30 ℃培养。
以P1和P2引物通过PCR扩增蔗糖酶SUC2基 因，1%琼脂糖凝胶电泳显示得到单一DNA条带， 长度约为3.2K bp，其与设计的目的片段长度相符， 结果如图1所示。
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图1 PCR 扩增SUC2 基因 M-DNA 标准物；1-目的基因PCR 产物 |
经PCR扩增后得到的SUC2基因，与分泌表达 载体pPICZαA连接，得到重组质粒pPICZαA-SUC2 （见图2）。将质粒送交Invitrogen公司测序，表达 载体pPICZαA-SUC2构建完成。
测序结果表明，扩增片段中包含SUC2基因编 码区上游约1.5Kbp的区域，SUC2基因编码区和编 码区下游100bp左右的区域。其中SUC2基因编码 区长度为1599bp，编码的完整蛋白含532个氨基酸 残基。编码蛋白与酿酒酵母EC1118(GenBank: CAY80344.1)同源性最高，99%序列匹配。其中本实 验扩增的SUC2基因编码的蛋白在第425位、431 位分别为丝氨酸、丙氨酸。而EC1118的SUC2基因 相同位置编码的氨基酸则分别为亮氨酸、缬氨酸。
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图2 重组质粒pPICZαA-SUC2 的结构示意图 |
毕赤酵母细胞转化之后涂布于YPDS Zeocin抗 性平板上，3～4 d后长出单菌落。这些阳性菌落表 明载体重组进入毕赤酵母基因组，得到了具有抗性 的重组工程菌KM71H/ pPICZαA-SUC2。
本文克隆酿酒酵母AS2.1190基因组中的蔗糖 酶基因SUC2，构建了表达载体pPICZαA-SUC2，该 表达载体具有博来霉素和蔗糖酶基因2种筛选标记，为今后的外源蛋白表达提供了便利。将蔗糖酶 基因整合进入毕赤酵母基因组，筛选得到阳性克隆， 为毕赤酵母直接利用糖蜜作为廉价碳源进行大规模 培养打下基础。
| [1] | Macauley-Patrick S,Fazenda ML,McNeil B,et al.Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast,2005,22(4):249-270. ( 1)
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| [2] | Gellissen G.Heterologous protein production in methylotrophic yeasts.Appl Microbiol Biotechnol,2000,54(6):741-750. (1)
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| [3] | Carlson M,Bostein D.Two differentially regulated mRNAs with different 5 ends encode secreted and intracellular forms of yeast invertase. Cell,1982,28:145-154. (1)
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