2012
α-葡聚糖酶，又称右旋糖酐酶，是一种重要的 工业用酶，主要用在制糖工业、医药工业等。α-葡 聚糖酶能够很好地解决制糖工业中的葡聚糖问题 （如α-葡聚糖引起糖厂车间中管线、容器和过滤器 阻塞，煮糖过程过滤困难、结晶不正常等），在制糖 工艺过程通过添加α-葡聚糖酶去除α-葡聚糖是目前 最佳选择，这是因为：①α-葡聚糖酶消除α-葡聚糖 的效果是最好的，比其它澄清剂和化学助剂效果都 好，且不会引入新的杂质；②α-葡聚糖酶是由微生物发酵产生的，是无毒无害的环保产品。α-葡聚糖 酶还可应用于医药工业（如预防龋齿）、右旋糖酐生 产的分子量控制等[1,2,3,4]。
广州甘蔗糖业研究所将来源于油脂酵母的α-葡 聚糖酶cDNA克隆到毕赤酵母的表达载体pPIC9K 中，再转化毕赤酵母菌株，经筛选得到高效表达α-葡聚糖酶的基因工程菌株GS115-dex，并在5 L发酵 罐规模发酵得到α-葡聚糖酶。本研究对上述α-葡聚 糖酶的酶学性质进行初步的研究[5,6]，为其在制糖和 医药工业的应用提供理论依据。
各种分子量葡聚糖，购自Pharmacia公司；其 它试剂为国产分析纯。
DK-S24型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备 有限公司；调节式万用电炉，南通市长江光学仪器 有限公司；752N型紫外可见分光光度计，上海精密 科学仪器有限公司；精密pH计，梅特勒公司。
5 L 发酵罐培养重组毕赤酵母工程菌株 GS115-dex，发酵液在12000 r/min离心5 min，上 清 液适当稀释后即为本实验所用酶液。
（1）标准曲线：分别在5支50 mL试管中吸 取1 mg/mL的葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL， 以蒸馏水补加到1.0 mL。然后在每支试管中加入2 mL DNS试剂，于沸水浴5 min，迅速将其冷却，用 蒸馏水定容至25 mL。以1.0 mL蒸馏水加2 mL DNS 为空白管调零点，于540 nm下测定吸光度，记录 OD540，以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，以OD540 为纵坐标绘制出标准曲线。
（2）酶活测定：取0.9 mL浓度为20 mg/mL 的葡聚糖水溶液，置于45℃恒温水浴中至少保温5 min，然后加入0.1 mL α-葡聚糖酶酶液，精确反应 10 min，立即加入2 mL DNS终止反应，于沸水浴5 min，迅速将其冷却，用蒸馏水定容至25 mL，于 540 nm下测定吸光值，记录OD540。从标准曲线的 回归方程求得相对应的葡萄糖的量，并计算出酶活。 酶活定义：在上述条件下，每min从葡聚糖底 物中释放出1 μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活单 位，以U表示。
为表征酶液中酶活力(enzyme activity)的大小， 一般以单位体积所含的酶活表示，也称比酶活 （U/mL）。酶活力的大小可用在一定条件下酶催化 底物反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶 活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测 定酶促反应的速率。
由于酶的特性，酶促反应速率一般在5～30 min 内达到稳定，随后可能会因为各种原因使酶促反应 速率降低，因此选择合适的反应时间对表征酶活很 关键。α-葡聚糖酶与底物反应5、10、15、20、25、 30 min后取样测定，从标准曲线的回归方程求得相 对应的葡萄糖的量，并计算出酶活（图1）。由图1 可见，反应时间在10～20 min时酶活力都比较稳定， 因此可选择10 min作为测定α-葡聚糖酶酶活力的反 应时间。
|
图1 反应时间对测酶活性的影响 |
根据酶活定义，底物必须过量，但过量太多则 造成浪费。根据理论计算，设计底物浓度分别为5、 10、15、20、25、30 mg/mL，测定经稀释合适的酶 液的酶活（一般控制OD540在0.4～0.6之间是最合 适的，在本实验中，酶液的酶活控制在30～60U之 间比较合适，高酶活的则需要适当稀释）。由 图2可 知，在底物为5~20 mg/mL的浓度范围内，随着浓 度的升高，酶活力与底物浓度成正比；当底物浓度 超过20 mg/mL后，酶活趋于稳定，说明20 mg/mL 浓度底物已过量。因此可选择底物浓度为20 mg/mL。
|
图2 底物浓度对测酶活性的影响 |
每一种酶的催化反应都有适宜的温度范围和最 适温度。在适宜的温度范围内，酶才能进行催化反 应，在最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最 大。温度对酶反应的影响主要有2个方面：一方面 是当温度升高时，反应速度也加快，这与一般的化 学反应一样；另一方面，随温度升高会使酶逐步变 性，即通过减少有活性的酶而降低酶的反应速度。 因此酶反应的最适作用温度就是这2种过程平衡的 结果：在低于最适温度时，以前一种效应为主；在 高于最适温度时，则以后一种效应为主，随之酶活性会逐渐丧失，反应速度会下降很快。本实验分别 在35、40、45、50、55、60、65℃不同反应温度下 测定α-葡聚糖酶的酶活力。结果如图3所示。由图 可知，α-葡聚糖酶活力在40～55℃范围内较高，相 对酶活力在75%以上，其最适反应温度为50℃，超 过60℃后α-葡聚糖酶活力下降较大，至65℃时残余 酶活力仅为2%。
|
图3 温度对α-葡聚糖酶活性的影响 |
各种酶均有其最高的耐热温度，超过此值，酶 将被迅速破坏。在酶液未置于不同温度前，先测定 酶液的酶活，以其活力值为100%，然后将酶液分别 置于4、30、40、45、50℃下保温，每隔一定时间 取样测定酶活力，结果如图4、图5。由图4可知： 在4℃、30℃条件下保温28 h，酶活几乎没有损失， 说明该酶在常温以下放置比较稳定；而在40℃条件 下保温16 h，酶活只剩下40%，损失了60%，保温 28 h后，酶活只剩下8%，说明该酶不能在40℃下 放置过长时间。由图5可知：在45℃条件下保温10 min，酶活损失了约18%，保温30 min，酶活只剩 下44%，保温80 min，只剩9%；而在50℃条件下 保温10 min，酶活就只剩23%，损失比较严重，保 温30 min 以上，几乎完全失活，说明该酶不能在 40℃以上保存。
|
图4 不同温度下α-葡聚糖酶活性随时间的变化 |
|
图5 不同温度下α-葡聚糖酶活性随时间的变化 |
pH对酶催化反应影响的原因是多方面的。一方 面过酸过碱可能改变酶的空间构象，使酶失活，根 据程度不同，酶可遭受可逆或不可逆失活；另一方 面，也是我们要重点研究的，pH可改变底物的解离 状态，影响它与酶的结合，从而影响酶的催化效率。 大部份酶受其环境pH值的影响，在最适pH值下， 存在最大的酶反应速度，而最适pH值因底物种类、 浓度等不同而不同。用pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的缓冲液（用0.1 mol/L 的柠檬酸和0.2 mol/L的Na2HPO4配制的缓冲液配 制）配制底物来测定酶活力，结果如图6。由图6 可知：当pH为5.0时有最大的酶活；在pH值小于 5.0时，随着pH值的增大，酶活也逐步增加；但是 随着pH的继续加大，其酶活开始慢慢变小，到pH 值6.0时，酶活只有最大值的11%，pH为7.0时， 酶活几乎完全丧失。因此确定该酶的最适pH值5.0。
|
图6 pH对α-葡聚糖酶活性的影响 |
分别用pH2～7的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液与 适量酶液混合，于4℃放置24 h，在最佳条件下测 酶活力，结果如图7。由图7可知：在pH4～6之间 α-葡聚糖酶较稳定；pH低于4时极易失活，pH低 至2时残余酶活力仅为13%；pH在7时的残余酶活 力仅为34%。而且失活的酶液在重新把pH调回5 左右时，依然没有恢复活性。
|
图7 酶的pH稳定性 |
酶对不同的分子量底物催化速率是不同的。为 了考察酶对不同底物的作用，分别配制2 mg/mL的 T5、T40、T500、T2000底物溶液，在最佳条件下 测定酶活力如图8，由图8可知分子量越大，酶的 催化作用就越好，催化作用最好的是T2000。
|
图8 底物对α-葡聚糖酶活性的影响 |
|
图9 金属化合物对酶活的影响 |
将不同类型的保护剂与α-葡聚糖酶混合，45℃ 水浴25 min(酶活损失50%的温度和时间)，立即冰 浴，测其残余酶活力。以4℃放置未加保护剂且未 处理的酶活力为100计，计算酶活保留率。并与未 加保护剂而经过同样热处理的α-葡聚糖酶的酶活保 留率进行比较，结果如表1。
|
表1 不同保护剂对α-葡聚糖酶稳定性的影响 |
从表中可以看出，不同的保护剂对该酶都有一 定的效果：蔗糖的保护效果最好，且浓度越大，效 果越明显；甘油次之；氯化钠效果最差。这样的结 果也表明，该酶用在制糖工业中是较适合的，因为 蔗糖不但不影响该酶的使用，还可以起保护作用。
本文确定了测量α-葡聚糖酶酶活的最佳方法， 并对α-葡聚糖酶的酶学性质进行了初步研究。研究 结果表明：①底物浓度为2.0 mg/mL的T2000葡聚 糖，反应时间为10 min测酶活是最适合的；②该酶 的最适反应温度为50℃，在30℃范围内放置，其相 对酶活力都在85%以上，损失不大，在30℃以上放 置保存，损失较快；③该酶的最适反应pH为5.0， 在pH为4～6的较窄范围内较稳定，小于4或大于6 酶都比较易失活；④Fe3+、Mg2+和Co2+对酶有激 活作用，Ca2+、K+、Zn2+、Na+、Al3+的作用不是很 明显；Cu2+、Ba2+、Fe2+、Sn2+、Ag+对酶有抑制作 用；⑤蔗糖对该酶起到很好的保护作用，浓度越高 效果越好，甘油次之，氯化钠效果最差。通过对该 酶的测定和酶学性质的研究，为下一步利用和纯化 该酶奠定了理论基础。
| [1] | 梁达奉,曾练强,郭亭,等.葡聚糖对制糖工业的影响及对策[J]. 甘蔗糖业,2008(6):31-33. ( 1)
|
| [2] | Efraín Rodríguez Jiménez.The dextranase along sugar-making industry. Biotecnología Aplicada 2005,22 :20-27. (1)
|
| [3] | 谭海平.α-1,6葡聚糖酶的研究进展[J]. 国外医学口腔医学分册.2001,28(1):14-16. (1)
|
| [4] | Frank Hoster,Rolf Daniel,Gerhard Gottschalk.Isolation of a new Thermo- anaero bacterium thermosaccharolyti-cum strain(FH1) producing a thermostable dextranase.J.Gen.Appl.Microbiol.2001,47:187-192. (1)
|
| [5] | 张秀艳,何国庆.微生物源β-葡聚糖酶的稳定性研究[J]. 浙江大学学报:农业与生命科学版.2007,33(4):387-391. (1)
|
| [6] | 魏晓飞,王在贵,陈建,等.β-葡聚糖酶的酶学性质研究[J]. 中国饲料,2007(9):17-19. (1)
|