2012
2. 广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室, 广东广州510316
2. Guangzhou Sugarcane Industry Reasearch Institute, Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316
随着国内外糖品市场竞争的激烈化及品质意识 的提升，越来越多的人意识到糖料甘蔗品质对制糖 效率、成本以及产品质量的影响。制糖工业中通常 以一些利于高糖分收回的因素作为甘蔗品质评定的 指标，那些蔗糖分高、纯度高、纤维素含量低、非 糖分少的甘蔗被公认为是品质好的甘蔗[1]。这种衡 量标准对于新鲜、完整的甘蔗评定是合理的，但是 对于受微生物感染而变质的甘蔗评定是不完善的。
糖料甘蔗在采收后由于微生物感染会产生新陈 代谢产物如有机酸、乙醇、甘蔗葡聚糖、低聚糖、 甘露醇等。这些成分由于对糖分收回以及加工过程 的影响使得它们有特殊的重要性[2]。可滴定酸度指 标（TAI）是衡量甘蔗恶化变质有价值的指标之一[3]。 在南非，乙醇的积聚曾被作为甘蔗提取中糖分损失 的指标以及由火烧到破碎延误的指标，火烧蔗中乙 醇含量是非火烧蔗中的2～3 倍[4]，但是后来证明乙 醇不能作为甘蔗变质的一个非常有用的指标[5]。甘 露醇形成速率远高于协同产生的低聚糖或者乙醇， 甘露醇被认为是甘蔗变质的一个最可靠的指标[5,6,7]。
但是以上几种因素所带来的危害远远没有甘蔗 葡聚糖的大。甘蔗葡聚糖主要是在甘蔗变质期间形 成的，是甘蔗变质的直接产物。其存在直接或者间 接地给制糖工艺过程带来了不良的影响，间接损失 据估算可以达到直接损失的3～5 倍。因此，蔗糖分 相近、葡聚糖含量差异很大的甘蔗，糖分的收回差 异也很大。伴随着甘蔗收获的机械化，蔗段被砍成 小段，以及在收获、运输、及时压榨之间良好协调 难度的增加等使甘蔗葡聚糖的形成剧烈地增加，其 带来的问题越来越凸显，所以不能简单地以蔗糖分、 纯度等作为划分甘蔗品质好坏的指标，葡聚糖在甘 蔗或者蔗汁中的含量成为衡量甘蔗品质的新指标。 实际上，要生产高品质的糖一定要除去甘蔗或蔗汁 带来的葡聚糖，成品糖若含有葡聚糖其适用性会受 到限制。
由于行业竞争的激烈及市场品质意识的提升， 越来越多的海内外消费者强烈要求原糖低葡聚糖含 量。在由中国国家标准化管理委员会发布的《原糖》 国标（GB15108-2006）[8]中首次增加了葡聚糖（≤ 400mg/kg）这一项指标。
专家们对葡聚糖的问题已经开展了广泛的研 究，葡聚糖的定量分析是重点之一。现有葡聚糖的 测定方法基本上可分为2 类 ：一类是根据化学分析 的方法，如酒精Haze 法、罗伯特铜法、SPRI 法等； 还有一类是根据其生物学性质的方法，如酶解法， 免疫法。无论是化学分析方法还是生物学性质的方 法，均或多或少地受葡聚糖分子量的影响。对于现 存方法的评价可以用一句话概括：即现存的葡聚糖 定量检测方法要么检测速度太慢，通常受其它多糖 的影响，或者需要特殊的仪器，又或者分析成本很 高等[9]。寻求快速、简便、准确的葡聚糖定量测定 方法是一个亟待解决的问题。
自然界的葡聚糖种类有很多，如淀粉、纤维素、 右旋糖酐、左旋糖酐、糖原、香菇多糖等[10,11,12]，根 据糖苷键及空间结构的不同大致分为α和β两种。 在制糖工业，甘蔗中产生的天然的葡聚糖是α-葡聚 糖，是一定程度α-D 吡喃葡萄糖（主要是α-（1→ 6）结构的葡萄糖）聚合物的共同称谓[13]。它是肠膜 明串珠菌属产生葡聚糖蔗糖酶将蔗糖转化成葡萄糖 后聚合的多糖，分子量1.5×104～2×106 或者更大 [14,15,16,17,18,19]。通常所有从甘蔗产品中分离出的高纯度葡聚 糖（被指定称为甘蔗葡聚糖）被发现拥有一串非常 类似结构的即95％的α-（1→6）和将近5％的α- （1→3）糖苷键[20,21]。
在新鲜、完整的糖料甘蔗中，葡聚糖的含量几 乎为零。但当甘蔗受到砍、烧、风折、机械压伤、 病虫害或霜冻等以致组织暴露于空气中，就容易受 到肠膜明串珠菌的感染，在适宜的湿度和温度下产 生甘蔗葡聚糖。蔗糖首先分解成葡萄糖和果糖，其 中葡萄糖在微生物肠膜明珠菌 (Les.Mesenteroides) 产生的葡聚糖蔗糖酶（Dextransucrase）作用生成葡 聚糖，留下的果糖经降解生成有机酸和色素等。其 反应过程如图1[22]所示。
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图1 肠膜明串珠菌产葡聚糖过程 |
影响甘蔗葡聚糖形成的因素，按产生的阶段可 划分为田间环境（Field condition，即由蔗田到压榨 机这个阶段）以及进厂压榨后阶段。具体有：甘蔗 品种特性；甘蔗生长周围环境；收获方式；收获和 压榨之间的间隔时间；甘蔗堆的大小和储存条件；坯料的大小等。
前美国制糖工业研究所所长Clark[23]认为甘蔗 葡聚糖产生原因中田地环境是主要影响因素，大部 分的葡聚糖是在这个阶段产生。按照这个阶段归纳 的影响条件可大致分为①甘蔗的品种、种植方式及 生长条件；②甘蔗收获方式、条件及运输时间、条 件。具体说明如下。
（1）甘蔗品种和种植方式
抗旱、抗冻、抗虫等品种可通过减轻旱、冻、 虫等的伤害而减少微生物的侵害，从而减少葡聚糖 的形成。品种本身的特性（如蔗皮厚度、蔗茎坚硬 程度、蔗蜡覆盖层等）也决定其被微生物感染的容 易程度。Clark 曾说：甘蔗品种对葡聚糖含量有关系， 不同品种的正常蔗的葡聚糖含量也不同，特别是在 霜冻蔗中这种关系更明显，具体可能是通过破裂度、 pH 成分等间接影响。此外，宿根比新植蔗易感染微 生物。
（2）生长条件
生长条件包括土壤类型和气候（降雨量、环境 温度）。具体如：土壤中含钾和镁的多少会影响甘蔗 葡聚糖的含量，土壤里盐类高可能会降低细菌的感 染；热会加快葡聚糖的生成；高温、干旱、低温、 潮湿等极端气候下，甘蔗易感染微生物而产生葡聚 糖；台风、暴雨等天气也使甘蔗易于受到伤害，从 而感染微生物而产生葡聚糖。
（3）收获条件
甘蔗收获条件即收获方式及收获后的处理方式 不同，微生物感染机会也会有差别（表1），具体数 据见表2、表3。
 | 表1 收获方式及收获后处理方式对葡聚糖形成的影响 |
| 表2 火烧蔗和青蔗切断后葡聚糖含量 |
| 表3 砍蔗至压榨时间对葡聚糖产生的影响 |
甘蔗堆存时间对甘蔗中葡聚糖的产生有影响， 随着堆放时间的延长，葡聚糖的含量明显增多，这 种现象在破裂的蔗段中表现的更为明显。
综上所述，甘蔗品种、种植方式甘蔗火烧的程 度、蔗茎的完整性、蔗段的长度、由烧到砍的时间、 由砍到压榨的时间；收获运输条件（因这种微生物 是厌气性的，下雨天泥多，若甘蔗附着很多泥，使 甘蔗与空气隔开，有利于细菌生长。加上下雨天收 获与运输均受拖延等因素，温度高、泥又多则是最 坏的情况。）均影响甘蔗葡聚糖的形成。
从蔗汁到精制产品，所有制糖工艺过程自始至 终存在着葡聚糖。据文献记载，在甘蔗糖厂处理过 程中，糖中葡聚糖的含量超过750ppm，甘蔗汁中更 可以远远超过5000ppm[9]，其对制糖工业的影响基 本上都是不利的。
近些年来，虽然国内大部分糖厂生产卫生条件 有很大改善，葡聚糖的直观影响（形成“蔗饭”）已 经很难看到，但是葡聚糖从砍获甘蔗时就已经开始 形成。蔗糖损失93%是由于微生物，5.7%是由于酶， 1.3%是由于化学降解[5]。
微生物感染甘蔗，以蔗糖为养料，直接造成了 蔗糖分的损失如下（表6）。
| 表6 葡聚糖的含量对蔗糖损失的影响 |
甘蔗葡聚糖粘度、旋光度值大，而且可以分解 产生拟黑色素、有机酸类、高粘度的胶体使其间接 的危害更为严重。影响方式如下：
（1）虚假升高的旋光度。由于蔗汁中的葡聚糖 的存在，造成蔗糖含量分析的误差，进而引起一系 列的工艺参数的错误。这是由于糖液中葡聚糖的比 旋光度为[α]D20 =198o，而蔗糖为[α]D20 =66.6 o，是蔗 糖的3 倍之多，葡聚糖含量过高会造成仪器旋光度 读数偏高。理论上，原糖中每333 ppm 的葡聚糖会 使原糖的糖度虚假增加0.15。同时，葡聚糖也干扰 锤度的测定，引起糖液锤度偏高的误差，造成糖厂 的物料平衡计算混乱，使收回率降低。
（2）粘度的增大。葡聚糖明显地增大糖液的粘 度，对高浓度糖液的影响更大。分子量越高，粘度 增大越明显，导致的结果是妨碍糖汁过滤，甚至会 影响传热，使蒸煮时间延长、废蜜的提净率降低、 助晶分蜜困难。
（3）影响纯度测定。葡聚糖的存在使糖蜜纯度 上升（原糖厂浓糖浆中每300 ppm 葡聚糖能使糖蜜 纯度上升1 度（平均））。
（4）影响结晶，形成伪晶。研究表明，葡聚糖 从糖浆到晶体的转移率在17%～25%左右，葡聚糖 含量低时，接近10%，当糖浆中葡聚糖含量超过5000 ppm，转移率迅度增加到30%以上[30]。精糖中如果 葡聚糖含量达到100～150 ppm，晶体会变形，有时 还会造成干燥困难。
以上几种影响最终均导致糖分收回率的降低， 而且随着糖液中葡聚糖含量的增大，糖分收回率减 少（表7）。
| 表7 葡聚糖影响糖分收回估计[31] |
除了直接和间接影响，蔗糖中葡聚糖的存在还 对产品的应用产生二次影响。澳大利亚的研究显示， 按照一般澄清、脱色工艺，糖浆中葡聚糖含量较低 时，最终的糖产品中会有10%的葡聚糖残留；而当 糖浆中葡聚糖含量较高时，最终的糖产品中会有 30%甚至更高的葡聚糖残留[32]。当这种葡聚糖含量 过高的产品如果用作生产其它产品的原料，会出现 饮料产生絮状物、浑浊，使糖果、巧克力成型困难 等问题。
总之，甘蔗葡聚糖是甘蔗变质的直接产物，其 存在所造成的影响，不论是直接、间接还是二次影 响，后果都非常严重，由此可以得出甘蔗葡聚糖是 衡量甘蔗品质的一个新指标。
在制糖工业，有几种不同的方法被用作葡聚糖 的检测，这些方法有Haze/ICUMSA 法[33]，Optical Activity Ltd. DASA 法[34] ，Robert’s 铜/AOAC 法[35] ‘MAU’ 法[36] ，ASI II 法[21] ， 酶解法， Midland SucroTestTM[37]以及SBAE 试纸条法[17]。
Haze 法是最早采用的方法，利用浊度原理进行 测定。1959 年，Nieholson 和Horsley 首次报道了用 浊度法原理测定葡聚糖[34]。这种方法的原理：首先 用淀粉酶移除样品中的淀粉， 接着用三氯乙酸 （TCA）沉淀蛋白质，然后过滤，最后用等体积的 无水乙醇沉淀溶液形成浑浊，这种浑浊度可以通过 分光光度计在波长720 nm 读取吸光度值间接反映 葡聚糖的含量（通常用葡聚糖T110 或者T500 作为 标准）。这种方法是衡量甘蔗严重变质的很好指标， 只有高分子量的葡聚糖才能在50％的酒精下形成浑 浊度。相对简单、精确、应用得也广泛，是ICUMSA 的正式方法。但是，这种方法在低纯度的样品中容 易受到其它杂质的影响。因此主要被用于原糖和精 炼糖的检测，如果用于其它样品中需要预处理。 CSRHaze 法作为ICUMSA 的试行方法一直到1986 年才被取消[37]。
另外，Clark 等报道了美国糖业加工研究有限公 司研究的简化的Haze 法称为Tilbury 修订法，这种 方法可在5min 内完成检验，被命名为SPRI 快速扫 描实验法[38]。此方法受到蔗汁成分的影响，适合于 常规检验。
现行原糖国标（GB15108-2006）测定方法根据 Haze 法进行改进，检测对象主要针对原糖。
这种方法的原理是用80%的酒精分离糖液中所 有的多糖，然后再用碱式硫酸铜处理这些收集到的 多糖，通过形成铜-葡聚糖络合物而分离出葡聚糖。 用硫酸水解分离葡聚糖，所得的葡聚糖与苯酚显色， 再通过分光光度法测定。修订的罗伯特铜法是用过 滤代替铜-葡聚糖络合物离心分离。起初这种方法被 认为对于所有分子量的葡聚糖均具有专一性。实际 上，相比检测所有的葡聚糖，它对高分子量的葡聚 糖检测性更好。它和Haze 法没有很好的相关性，被 用于甘蔗汁、糖蜜和糖浆的检验。
和Haze 法类似，但是包括了一个通过离子交换 除灰阶段，结果是千分之一吸光度单位（MAU）， 百万分之一吸光度单位可以通过ppm=（MAU+118） /0.659 计算。这就避免了作标准曲线所涉及的葡聚 糖相对分子质量问题。这种方法用葡聚糖T40 作标 准曲线，但是线性效果不是很好，也许是因为吸光 度和葡聚糖的含量不成线性关系，或者不同分子量 作为标准曲线应该被应用。
在寻找比罗伯特法更标准化和比SPRI 法更快 捷的方法方面已经开展了大量的研究。应用葡聚糖 酶、葡聚糖抗体等免疫化学的实验使葡聚糖的测定 方法接近于标准化大有希望。
ASI II[12]是一种预先用淀粉酶降解，伴随用葡 聚糖酶和α-葡萄糖苷酶分析酒精沉淀量的方法，所 得结果是葡聚糖转换成葡萄糖的量， 这可以被 Nelson-Somogyi arsenomolybdate 法量化。
DASA(葡聚糖和蔗糖)分析系统[37]是英国旋光 仪器公司(OPTIC 汉LACTIVITY) 与伦敦的 Westminster 大学和牙买加的糖业研究所合作开发的 一种用近红外光谱仪检测葡聚糖酶解前后旋光度的 不同。这种方法被报道由于酶解不充分抑或过滤不 充分，葡聚糖的含量值错误增高[38]。
美国糖业研究院的Brown 和Inkerman[37]研究出 用酶法测定还原糖中葡聚糖含量的HPLC 定量分析 法，但是这种方法操作过程技术性要求高而且耗时。
Morel du Boil PG、Zimmer B、Thielecke K 等人 用Enzyme-HPEAC 法[39]间接测定了葡聚糖含量。这 种方法的原理是：多糖被50％或者80％的酒精沉 淀，区分开全部葡聚糖或者仅仅是高分子量的葡聚 糖，再溶于水中，用葡聚糖酶水解，通过用色谱测 定产生的异麦芽糖含量来反映原始的葡聚糖含量。 这种方法具有高度的专一性，但是时间冗长，成本 高，不适用于日常或者需要快速出结果的分析中。 高分子量的葡聚糖出来的结果和Haze 以及免疫法 一致性好，与Robert’s 铜/AOAC 法结果不一致。
国内梁达奉、徐建光[40]等人在酶解法定量检测 葡聚糖方面也做了研究，发现酶解法虽具高效专一 性，污染小、操作简单、酶解产物分布稳定等优点， 但是也存在耗时长、葡聚糖酶不能完全分解葡聚糖 等缺点。
当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例 合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复 合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用 下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。 当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检 样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增 加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照， 即可计算出检样中抗原的含量。反应方程式如下：
Ab +AG↔AbAG↓+Ag↔Ag2 Ab
式中：Ab——抗体，这里代表葡聚糖的抗体； AG——抗原，代表葡聚糖；AbAG——产生的抗原 抗体络合物沉淀；Ag——过剩抗原；Ag2Ab——可 溶性络合物。
在早期，澳大利亚的curtin[37]曾尝试过用免疫 分析法对葡聚糖进行分析。Sarkar 等人1991 年将 Haze 法和ASI II[21]、GPC 法[34]以及一种多克隆和单 克隆抗体测试方法进行了比较。由于葡聚糖高程度 的分支，需用酶的ASI II 法被怀疑测定的葡聚糖浓 度低于实际浓度。GPC 对分类有困难并且不是对所 有分子量的葡聚糖敏感。抗体法对于分子量低于150 kDa 的葡聚糖检测不出来。
后来，米兰公司研制了抗体试剂盒，用葡聚糖 T2000 作为标准，利用免疫学反应，即单克隆抗体 （抗体）和葡聚糖（抗原）之间的反应产生浊度来 检测葡聚糖的含量即Midland SucroTestTM 法[42]。 它是一种利用单克隆抗体葡聚糖含量提高产生浊度 线性增加的免疫学方法，它的测试与Haze 法结果显 示一致并具有有很高的相关性[43]。具体过程：在 1 mL 或者2 mL 抗体中加入10μL 的样品，1 min 后读出浊度计中显示的数，最后根据所读的浊度变 化值在标准曲线上读出葡聚糖含量。葡聚糖抗体具 有专一性，反应不受葡聚糖分子大小的限制，但浊 度的形成受分子大小的影响。因此这种方法被证明 对分子量为T40 的葡聚糖敏感性较弱，当分子量低 于T40 时浊度不能被检测到[43]。这种试验方法快速、 利用最少的实验器材，对葡聚糖有高度专一性。
目前，国外已有部分糖厂采用免疫法[43]进行检 测，但由于所需要的抗体相当昂贵，在国内糖厂还 没有被使用的报道。
国内广州甘蔗糖业研究所和厦门大学医学院 抗癌研究中心共同研制葡聚糖特异性抗体，已经成 功制备出葡聚糖单克隆抗体，生产出国内首个葡聚 糖单克隆抗体免疫比浊检测试剂盒DextraTest，随 着试剂盒在国内糖厂的普及应用，快速、准确的免 疫学方法在甘蔗在制品、制品中测定葡聚糖将成为 可能[44]。这种方法检测时间很短（3～5 min）、便捷、 专一，而且适用于所有糖厂产品，检测时只需要简 单的过滤作为预处理，样品用量也很少（10μL）。 但是对于分子量小于40000 道尔顿的葡聚糖未能检 出。目前，利用这种抗体，梁达奉、颜江华、曾练 强等人已建立了相关定量检测方法，并对原糖、白 砂糖、糖蜜、蔗汁等产品或物料中葡聚糖的定量检 测进行研究比较[45,46]，如葡聚糖多克隆抗体竞争抑 制ELISA 检测方法[45]等。表8 是2 种试剂盒的对 比[46]。
| 表8 国外国内抗体检测盒比较 |
此外，Duwoon Kim，Seok-Ryel Kim 等人建立 了一种SBAE 试纸条[17]简单、快速的测定方法，可 以最低检测到31.5 ppm 的葡聚糖，但是在125 ppm 时表现饱和。
综上所述，免疫比浊法具有操作简单快捷，灵 敏度高，不需要特殊仪器和设备等优点，适用于测 定各种甘蔗样品。但是，由于高分子量的葡聚糖能 在蔗汁澄清时被优先除去，余下中低分子量的葡聚 糖，故在原糖或者耕地白糖中，中、低分子量的葡 聚糖对总葡聚糖的比例是高于蔗汁的，对于低分子 量葡聚糖的检测成为免疫比浊法将来集中解决的问 题。
综上所述可以得出：
（1）糖料甘蔗中葡聚糖的形成受田地环境和压 榨进厂后阶段可以说是从种植到成品全过程影响， 其对制糖工业有严重的负面影响越来越受到国内外 同行的关注，因此甘蔗葡聚糖作为评定糖料甘蔗品 质的一个重要的新指标是必然趋势。
（2）伴随着抗体制备及纯化技术的日益成熟， 免疫学检测法将成为一个很有希望的方向。利用单 克隆抗体检测的免疫比浊法具有操作简单快捷、灵 敏度高的优点，而且也适用于制糖生产过程中各种 各样的样品。但是由于葡聚糖理化性质的特殊性， 对某些低分子量甘蔗样品的定量分析成为研究的难 点和瓶颈，未来将寻找出合适的免疫学方法集中解 决分子量问题。
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