在特异染色体类型上重复元件可达10⁶拷贝 数，现已有大量的重复序列，主要包括rDNA基因、 端粒重复序列、着丝粒重复序列等被克隆^[5]，这些 序列定位于染色体的着丝粒或端粒，当标记和杂交 具有足够严谨性时，这些探针在着丝点附近或特异 染色体类型的异染色质区和间期染色质的浓缩区域 产生强烈和浓缩的杂交区域。主要用于快速检测染 色体单体、三倍体、染色体基数及倍性研究^[6]。

从基因组DNA文库中分离出来的全长染色体 探针，用于鉴定染色体的异位或畸变。

利用某一物种的基因组DNA作为探针，与另 一物种的染色体进行原位杂交，可用于分析异源多 倍体基因组组成、起源、演化以及基因组间的亲缘 关系。在高等植物基因组中序列重复很常见，编码 序列在染色体总DNA 中的比例只有不足0.5%， 中度和高度重复序列构成了植物基因组的绝大部分 DNA序列。但是并非所有的重复序列都具有物种 特异性，表明其具有很低的进化保守性。由于它们 在探针和目标DNA 中具有较高频率，重复序列退 化比高度保守的单一序列更快。因此，当总DNA 作探针时，应依据各染色体组DNA同源性程度的 差异进行种属特异性标记。

单拷贝或低拷贝基因作为探针的应用发展缓 慢，原因在于植物细胞壁阻碍探针与靶序列的结 合，并且多数低拷贝序列是几个kb 小片段，探针 与靶序列相遇的几率很小，杂交位点检测率随探针 大小的降低而降低。然而，尽管较低的杂交效率 (20%～50%)，该方法在植物上已起步，如检测豌 豆中的豆球蛋白基因的DNA序列，用生物素标记 的探针检测豌豆中的低拷贝序列(13.5 kbp)等^[7]。近 几年，使用BAC-FISH技术使上述2个问题得到了 一定程度的解决，大大提高了信号的检出率^[8]。它 主要用于功能基因的定位和检测靶细胞特定的拷贝 数和结构变化。

最初，人们普遍采用将含有放射性同位素的核 苷酸掺入探针中，杂交后，再通过放射自显影技术 显示杂交位置的原位杂交技术分析原核生物的 DNA序列组织。这种标记方法的特点是灵敏度高， 杂交信号强，但它不安全、不稳定、背景不理想、 周期长，并需要进行大量的统计学工作。

非放射性标记弥补了放射性标记的不足，它的 检测方法简单、快捷；在化学性质上稳定，能通过 几次免疫化学反应显著地增加杂交信号，从而提高 灵敏度，杂交信号定位更准确。根据标记和检测特 点的不同可将非放射性原位杂交分为直接法和间接 法2种。直接标记法：正如同位素法标记探针一样，这类方法是指掺入到探针中的标记物在杂交后可被 直接检测到。这种标记物大多为在激光下能发荧光 的物质，故也叫荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)。其常用的标记物有异硫氰酸 荧光素(FITC)、氨甲基香豆素醋酸酯(AMCA)和罗 丹明衍生物(TRITC)等。这些标记物掺入到探针中 后可用荧光显微镜直接观察杂交结果。如用不同颜 色的荧光素标记不同的探针可同时定位2种以上的 靶序列。快速、准确、颜色对比鲜明。与间接法相 比，操作简单、结果背景干扰较少，但信号不能放 大，其灵敏度相对较低^[9]，并很快为间接法所替代。 间接法是指掺入到探针中的标记物不能被直接观察 到，必须通过耦联复合物专一地结合到杂交后的探 针标记物上，通过特殊的检测方法，来显示杂交位 点。这种方法最常用的标记物是生物素(Biotin)和 地高辛(DIG)。

生物素：用于间接标记法的标记物，也是最早 使用的非放射性标记物。常用的生物素标记核苷酸 有Biotin-16-dUTP、Biotin-11-dUTP、Biotin-14-dATP 和Biotin-7-dATp，这些核苷酸通过缺口平移或随机 引物等方法掺入到探针中，杂交后通过免疫反应使 生物素与荧光素标记的抗生物素蛋白或链酶抗生物 素蛋白结合，杂交信号可在荧光显微镜下观察，也 可通过二抗使信号进一步放大。

羟基毛地黄苷：商品名叫Digoxigenin，简称 DIG，是20世纪80年代发展起来的一种新型非放 射性标记物。常用标记核苷酸为digoxienin-11-dUTP，DIG标记系统中的所用标记方法和检测方 法同生物素标记系统。

生物素和地高辛标记系统都已得到广泛应用^[10]， 二者相比地高辛标记系统的灵敏度较高，因为在原 核和真核生物中普遍存在着内源性生物素的干扰， 抗生物素蛋白对内源生物素存在非特异性结合，使 标记本底增高。

压片法是植物染色体制片的常规方法，它简单 且易操作，许多植物染色体核型分析、显带和原位 杂交都是用这种方法完成的。但成功率较低，主要 是因为染色体很难完全散开，容易产生重叠、变形、 断裂等，此外细胞质及细胞壁对染色体的覆盖，使 原位杂交的信噪比增高。具大染色体的植物材料如 普通小麦可用上述方法制片，但具小染色体的植物 材料不适用此方法，因为获得的制片很难区分染色 体上的各个部位。去壁低渗火焰干燥制片法必须考 虑几个重要因素如前低渗处理时间、混和酶液的浓 度、酶解时间和酶解温度以及后低渗处理时间等。 低渗的目的在于使细胞吸收水分而膨胀，染色体分 散到细胞质中，在制片时便于染色体分散开，不同 材料低渗的最佳时间不同，未经低渗处理的材料， 细胞核膨胀的较小，染色体不易分开，而低渗处理 过度，使细胞在低渗液中胀破，造成材料解体；酶 解温度必须恒定，酶液浓度应控制在2%～5%，根 尖材料为2.5%左右，树木幼叶、幼芽可用5%左右； 此外，酶解时间是个变化的因素，要根据材料的不 同做适当调整，材料过大，会使酶解时间成倍增加， 材料过多，会导致消化不足，酶液量过多会使酶解 时间不易稳定。去壁低渗火焰干燥制片法又可以分 为涂片法和滴片法，对于滴片法而言，上述因素同 样重要，此外在滴片法中细胞悬液的制备也是实验 成功与否的关键，Mouras等^[11]用机械力将酶解的 材料捣碎后，100 ×g 离心的方法获得悬液。此法 不但手续麻烦，效果也并非很好。用静置片刻去沉 淀和静置20～30 min 去上清液的方法，既简单且 细胞收率也高，在上清液中有大量的被酶解离的细 胞碎片，采用离心的方法，这部分碎片很容易与细 胞混在一起，妨碍染色体展开。滴片法要求条件比 较严，酶解和后低渗的时间必须合适。2 种方法同 压片法相比不但操作复杂而且费材料和成本。但是 能够获得良好的效果^[12]。

在通常的原位杂交技术中，多以中期染色体 (Metaphase chromosome)作为靶DNA的载体，由于 受染色体结构高度凝缩的影响，其分辨率只能达到 1～3 Mb的水平。然而这对于构建高分辨率的DNA物理图谱来说，1～3 Mb 的分辨率水平是还不够 的，必须寻找分辨率更高的技术。而减数分裂的粗 线期染色体(Pachytene chromosome)浓缩程度比中 期染色体大为降低，其长度比相应的中期染色体大 7～50倍，粗线期染色体FISH的分辨率可达100 kb 左右。粗线期染色体还具有可识别的结构特征，包 括着丝粒位置、短臂和长臂的比例、异染色质和常 染色质的形态等，另外，粗线期染色体所在的细胞 几乎不存在细胞壁，染色体延展良好，且同源染色体配对提供了2个目标区域增加了一倍，以上这些 特点说明了粗线期染色体可适用于原位杂交及物理 作图。Albini和Schwarzacher^[13]在黑麦粗线期染色 体上成功地进行了重复序列的定位研究。

与分裂期的染色体相比，间期细胞核的染色体 凝缩程度很低，FISH的分辨力可提高到50 kb ^[14]。在人类间期核的FISH分析中发现，当2个探针的 间距在100 kb至2 Mb时，间期FISH作图可用来 测定染色体上2个相邻序列间的物理距离，不过， 间期核缺乏可辨别的染色体结构，无法分辨单个的 染色体，不能确定FISH信号相对于着丝粒、端粒 和其它染色体标记的位置；而且在不同的细胞类型 和染色体区域，染色质的凝缩模式和程度不同，必 须有相应的对照标准。这些不利因素限制了间期核 FISH的应用。

近年来，利用间期核制备高度伸展的DNA纤 维(Extended DNA fiber)作为FISH的模板，已将分 辨率水平提高到与常规分子生物技术Southern Blot 分析相当的水平，在1 Mb 的范围内，Fiber-FISH 分辨力达到1～2 kb，灵敏度可达到＜700 bp^[15]。 该技术首先在人类细胞中获得成功^[16]。其基本原理 是，首先将单细胞悬浮液涂在载片上，然后用碱性 变性剂将染色体的结构破坏，让DNA分子与复合 的蛋白质分离而形成游离的DNA纤维，在这种纤 维上进行原位杂交。利用这一项技术，可以开展 YAC、BAC、黏粒、噬菌体和质粒DNA克隆在DNA 纤维上的线性排列顺序并准确地构建出DNA物理 图谱。

最近Valárik等^[17]发展了一种超伸展的流式分 拣植物染色体(Super-stretched flow-sorted plant chromosome)高分辨FISH技术。流式分拣的大基因 组(包括大麦、小麦、黑麦和鹰嘴豆)染色体在玻片 上干燥后经温和的蛋白酶K消化和乙醇:冰醋酸(3:1) 伸展，可获得比中期染色体长100倍以上的伸展的 染色体纤维。由于这种超伸展的染色体之间不重 叠，又保持了染色体的完整性，并有较大范围的伸 展程度，可以用于研究染色体的超微结构，因此与 Fiber-FISH技术相比具有一定的优势。此FISH技 术特别适合于难以进行粗线期染色体FISH研究的 大基因组。它的不足是需要用流式细胞仪分拣染色 体。

多数用于遗传作图的RFLP不能直接用于FISH 物理作图。用RFLP从基因组文库筛选含大插入片 段的BAC克隆，然后用这些克隆在粗线期和/或有 丝分裂中期染色体上进行FISH物理作图，是一种 十分有效的植物基因组(DNA)物理作图策略。由于 用于作图的BAC克隆在遗传图上的位置是已知 的，因此在得出这些克隆的物理图的同时即实现了 物理图和遗传图的整合。值得指出的是，在玉米、 大麦、小麦等大基因组植物中，RFLP标记筛选的 BAC克隆含有很多的重复序列，而含单一序列很 少，在没有用非标记的重复DNA进行精确封阻的 情况下，其中的重复序列(主要是反转录转座子)往 往与基因组染色体的许多区域杂交，甚至涂染整个 基因组^[18]，因此大基因组难以用BAC-FISH进行基 因组物理作图。Stephens 等^[19]采用高灵敏度的 TSA-FISH技术，直接对大麦的RFLP(cDNA克隆) 进行了物理作图尝试，显示这种技术可以作为大基 因组FISH物理作图的一种可选择的方法。

小麦5B染色体长臂上携带着控制小麦部分同 源染色体配对的Ph基因，对该基因功能的研究有 利于育种家对小麦进行遗传操作。为了了解不同的 Ph的突变型控制细胞同源配对的机制，使用GISH 方法得到了比其它方法更进一步的研究结果^[20]。 Kenton等^[21]将双粒病毒的DNA序列定位于烟草T 基因组一个小染色体上，这是第一次观察到病毒 DNA序列整合到植物基因组。病毒DNA插入序列 物理作图在系统发育和植物进化研究中有特殊的应 用，对农作物基因工程和植物基因组计划是有重要 意义的，这是个特例。

远缘野生种具有许多对栽培种有利的基因，利 用远缘杂交手段将有利基因的异源染色质渐渗到植 物中形成新的种质，这是丰富植物种质资源的一条 有效途径。运用基因组荧光原位杂交(Genome in situ hybridization, GISH)方法跟踪检测杂种后代外源染 色体或片段，是一个快速、灵敏、准确、信息丰富的手段。它能对外源染色体或片段计数，显示它们 的大小、位点和形态以及与寄主基因组染色体的重 组，同时起到间接鉴定杂交品种真实性的作用。一 般以标记的野生种基因组总DNA为探针，以栽培 种亲本总DNA为封阻DNA，在杂种及其后代中期 染色体进行杂交，通过信号的有无来判断是否有野 生种染色质渗入。该技术，成功地鉴定了甘蔗种质 创新杂种F1 的真实性及回交后代染色体组成分 析^[22,23,24]。因此，无需经过基因表达产物来推断基因 转移是否，就能检测整合于染色体内的和游离的外 源染色质。

细胞遗传学中，研究减数分裂染色体的行为能 够更深入地了解基因组与基因组之间的关系，但过 去仅仅通过形态观察了解同源染色体配对，而现在 通过GISH，不仅能观察到存在配对的同源染色体 的来源，而且能观察到异源染色体易位互换重组现 象。Parokonny等^[25]应用GISH技术对烟草非对称 杂种及其有性后代减数分裂中的基因组行为、染色 体易位等进行研究。结果表明，染色体同源配对多 在减数分裂各个时期都可以检测到包含双亲染色体 片段的染色体易位现象，正常和重组染色体都能进 入二分体和四分体。对非对称体细胞杂种自交和回 交后代的分析表明，重组染色体可通过雌雄配子传 递，正在进行减数分裂或减数分裂以后也可发生染 色体重组，即出现新的重组。总之，研究表明，通 过基因组间易位，非对称杂种中一个亲本的染色体 片段可以稳定地整合进另一亲本，并传递给有性后 代。Gavrilenko等^[26]对栽培番茄与野生马铃薯体细 胞杂种(Lycopersicon esculentum＋Solanum etuberosum) 的减数分裂进行分析，发现番茄染色体有优先丢失 的趋势，对该体细胞杂种花药培养再生的4棵植株 进行GISH分析表明：双亲染色体在不同花药再生 植株中的贡献均不同，即1株为二倍体，双亲染色 体各贡献12 条，2 株非整倍体，分别多了番茄、 马铃薯的1条染色体，另1株为超四倍体，双亲各 贡献26条染色体。

王坤波等^[27]以亚洲棉品种石系亚一号的gDNA 为探针，采用棉属二倍体野生种瑟伯氏棉gDNA作 封阻，对海岛棉品种“海7124”的体细胞染色体 进行荧光原位杂交，结果清晰地观察出了显示红色 荧光的26 条染色体，这直观地说明了海岛棉的二 倍体起源。有少数染色体呈现红蓝2种荧光信号， 主要出现在染色体的长臂上。海岛棉6个随体，均 在染色体的短臂上，其中一对较大，较大的在显示 红色荧光的染色体上，但是随体本身显示兰色荧 光。另外2对随体本身显示红色荧光，但是均位于 较小的显示兰色荧光的染色体上。这些交互显示荧 光的结果说明，在海岛棉的起源演化过程中，起源 于2个亚组的染色体，彼此间发生了较大程度的交 换。