2011
甘蔗是我国主要的糖料作物，在我国食糖供应 中具有举足轻重的地位和作用，甘蔗糖占我国食糖 供应的90％左右[1]。由于甘蔗属于无性繁殖作物， 生产上一般用蔗梢作种，连续种植多年后种苗容易 感染或者积累病毒，造成产量、糖分大幅降低[2,3]。 生产健康种苗是一种有效的防治甘蔗病害、提高产 量和糖分、延长宿根年限的方法。已有研究结果表 明，利用甘蔗茎尖培养与热水处理等技术，可以有 效去除蔗株携带的花叶病毒、宿根矮化病病菌等， 减少因病害发生造成的甘蔗减产、糖分降低等[4,5]。 目前，世界上蔗糖主要生产国巴西、澳大利亚、古 巴等都建立了甘蔗健康种苗工厂化生产技术体系[6]。
近年来，我国各甘蔗育种科研单位都非常重视 健康种苗技术研究[7,8]，并且建立了健康种苗示范 和应用基地。但是，由于甘蔗遗传背景复杂[9]，品 种间遗传差异较大，在组织培养过程中不同品种间 对激素浓度的要求差异较大，不同品种在同一种培 养基上的繁殖系数可以相差几倍。繁殖过程中如果 繁殖效率低，不仅降低生产效率和增加种苗生产成 本，而且会严重降低种苗质量，对田间生产造成不 良影响。因此，为了促进甘蔗健康种苗在生产上的 应用，需要对生产上的主栽品种进行培养基优化实 验，筛选合适的激素浓度和组合，提高健康种苗繁 殖效率和质量。
正交试验设计应用于优化培养条件的生物学研 究，主要优点是能够在多试验条件中通过较少试验 方案找出最优方案或最佳培养条件。薛志平等采用 正交设计法[10]，考察不同因素对甘蔗愈伤组织分化 的影响。本研究通过正交试验分析不同激素浓度对 甘蔗丛生苗繁殖效率的影响，优化培养条件，提高 健康种苗生产效率和质量。
实验材料为ROC22、粤糖00-236。
培养基采用MS 培养基，根据6-苄氨基嘌呤 (6-BA)、噻苯隆(TDZ)、萘乙酸(NAA)、多效唑(P333)4 种物质间的浓度设立正交组合，采用L9(34)正交试 验设计，配比4 因素3 水平(表1)。选取高度为株 高2～4 cm，生长势好，生长状态一致的同一批次 茎尖分化出的丛芽苗，分别接入到各个培养基中， 每种培养基接种18 瓶，每瓶接3 丛。培养条件为 每天光照培养16 h，温度28℃，光强2000 lx。10 天后统计每瓶苗的分化芽数。
 表1 正交试验因素水平表L9(34)
| 表1 正交试验因素水平表L9(34) |
计算各个试验处理的平均值，用方差分析比较 各个处理间的差异显著性，统计分析采用SPSS 11.0 软件[11]。
从试验结果的方差分析可以看出(表2)，6-BA、 TDZ、NAA、P333 这4 个因素对ROC22 丛芽苗分 化的影响均存在极显著差异(P＜0.01)，但其影响程 度不同，对ROC22 丛芽苗分化影响的主次因素为 TDZ＞NAA＞P333＞6-BA。而这4 个因素对粤糖 00-236 丛芽苗增殖的影响与ROC22 也有明显不 同，P333 对粤糖00-236 丛芽苗分化的影响不存在 显著差异(P＞0.05)，而其他3 个因素6-BA、TDZ、 NAA 则表现极显著差异(P＜0.01)，从方差分析表 可以看出，各因素对粤糖00-236 丛芽苗分化的影 响主次顺序为6-BA＞TDZ＞NAA＞P333。
表2 6-BA、TDZ、NAA、P333 4 个因素方差分析表
| 表2 6-BA、TDZ、NAA、P333 4 个因素方差分析表 |
综合表3、表4 可以得出：ROC22 在6-BA 浓 度为A2 时，均数最大5.889，且A2 与A1、A3 之间 存在显著性差异（P＜0.05），A1 与A3 之间不存在 显著性差异（P＞0.05）。粤糖00-236 也是在6-BA 浓度为A2 时新芽均数最大12.833，与浓度为A1 时 的均数仅相差0.481，且2 者无显著差异（P＞0.05）， 但与6-BA 浓度A3 相比，2 者存在极显著差异(P＜ 0.01）。
表3 6-BA 单因素统计量表
| 表3 6-BA 单因素统计量表 |
表4 6-BA 浓度水平配对比较表
| 表4 6-BA 浓度水平配对比较表 |
综合表5、表6，可以得出：ROC22 在TDZ 浓度B3 时，丛芽苗分化出新芽的均数最大为6.148， 与TDZ 浓度B1 均数5.944 仅差0.204，2 者无显著 差异(P＞0.05)。粤糖00-236 在TDZ 浓度B1 时，新 芽均数已达到12.685，与浓度为B3 时均数12.074 相比，2 者无显著差异(P＞0.05)。
表5 TDZ 单因素统计量表
| 表5 TDZ 单因素统计量表 |
表6 TDZ 浓度水平配对比较表
| 表6 TDZ 浓度水平配对比较表 |
综合表7、表8，可以得出：ROC22 在NAA 浓度C2 时，丛芽苗分化新芽的均数达最大，与NAA 浓度为C3 新芽均数相比无显著性差异(P＞0.05)， 与未添加NAA 相比存在显著性差异。粤糖00-236 在NAA 浓度为C3 时新芽均数最大为12.722，与浓 度C2 无显著差异(P＞0.05)。但是，C3、C2 与C1 之 间存在极显著差异(P＞0.01)。
表7 NAA 单因素统计量表
| 表7 NAA 单因素统计量表 |
表8 NAA 浓度水平配对比较表
| 表8 NAA 浓度水平配对比较表 |
综合表9、表10，可以得出ROC22 在P333 浓 度D2 时均数最大为6.065，且D2 与D1、D3 之间存 在极显著差异(P＜0.01)。可见，ROC22 在P333 浓 度为D2 时，丛芽苗分化效果较好。粤糖00-236 也 是在P333 浓度为D2 时，新芽均数最大为11.944， D2 与D3 之间存在显著性的差异(P＜0.05)，但是D1 与D2、D3 之间不存在显著性的差异(P＞0.05)。从 粤糖00-236 在D3 时的新芽数小于D1 时的新芽数， 说明在使用P333 时要筛选合适的使用量，P333 使 用过多对新芽生长存在不利影响。
表9 P333 单因素统计量表
| 表9 P333 单因素统计量表 |
表10 P333 浓度水平配对比较表
| 表10 P333 浓度水平配对比较表 |
甘蔗不同基因型组织培养特性有显著差异，基 因型影响甘蔗愈伤组织诱导，增殖和分化[12,13]。本 研究以ROC22 与粤糖00-236 为供试材料，取茎尖 分化出的丛芽苗，在相同的培养条件下，使用相同 植物生长调节剂处理，ROC22 丛芽苗分化新芽数 明显低于粤糖00-236。可见，甘蔗基因型的自身特 性决定了该品种的丛芽苗分化能力，甘蔗组织培养 特性受遗传特性决定[14]。
外源激素的刺激使多酚氧化酶活性提高[15]，若 降低外源激素含量可大大降低酚害影响[16]，提高丛 芽苗诱导率, 而不同激素混合使用有利于降低分化 苗的变异率[8]。本研究在甘蔗丛芽苗分化增殖的阶 段，选用了2 种细胞分裂素类物质6-BA，TDZ。 粤糖00-236 的丛芽苗的分化在6-BA 浓度在0.5 mg/L 与1.0 mg/L 2 个水平，差异不显著。从降低 酚害影响，提高丛芽苗分化能力考虑，粤糖00-236 在繁殖阶段6-BA 浓度取0.5 mg/L 已达到较好繁殖 效果。岑秀芬等研究在甘蔗愈伤组织分化阶段[13]， 使用浓度 0.04 mg/L 的TDZ，并与其他激素合理配 组，可提高愈伤组织分化效果。而本研究表明在甘 蔗丛芽苗繁殖阶段若培养基中使用6-BA，再添加 TDZ 对丛芽苗增殖影响并不显著。如添加浓度不 适，反而会影响丛芽苗的增殖效果。可见，在甘蔗 组织培养中，应根据其不同时期生长需要，选取适 宜的激素组合。
在细胞分裂素与生长素存在适当比例时，芽的 诱导能高效进行。建立适宜的激素比例，尤其是生 长素/分裂素之间的最佳组合，是提高甘蔗品种繁 殖效率的最重要因素之一。研究中发现，ROC22 和粤糖00-236 新芽数最大时培养基中6-BA 的浓度 相同，但是NAA 和TDZ 的浓度都不同，由此可见 不同品种对生长素/分裂素的比例要求不一致，在 健康种苗繁殖过程中要针对某个品种筛选适宜的生 长素/分裂素的比例。
早在上世纪90 年代，植物生长延缓剂P333 已 应用于植物组织培养领域，并取得良好效果[17]。多 效唑的添加使得甘蔗丛芽苗健壮生长，植株叶色浓 绿，叶片平展，芽苗质量提高，有壮苗作用，并且 可保持芽苗良好的生长状态[18]。P333 对ROC22 不 仅有壮苗作用，在P333 浓度达到0.2 mg/L 时，丛 芽苗的分化新芽数也有增加。而粤糖00-236 对P333 的反映与ROC22 明显不同，植株生长矮壮，但丛 芽苗的分化并未受到显著影响。通过添加适量P333 可以明显降低株高，减少继代时的工作量。在甘蔗 健康种苗生产中，可根据植物组织培养生产计划， 适当添加P333，调节丛芽苗生长速度，调控丛芽 苗继代时间。
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