2011
2. 广州甘蔗糖业研究所广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316
2. Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute, Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316
葡聚糖(glucan)是以葡萄糖为组成单元的多糖 的总称，广泛分布于微生物、植物、动物界。制糖 工业中出现的葡聚糖主要为 α-葡聚糖（右旋糖酐） ， 由微生物作用于甘蔗和蔗汁引起葡萄糖聚合而成[1]。 它是一种高分子量的多糖聚合物，分子量可达数百 万。葡聚糖的产生和存在使蔗糖损失，它还明显增 大糖液的粘度，降低糖液的过滤性，影响煮糖、结 晶与分蜜，增加制炼成本，且严重影响糖产品的质 量。为解决葡聚糖对制糖工业的负面影响，利用葡 聚糖酶分解葡聚糖是目前最有效的方法[2]。 利用基因重组技术，将来源于油脂酵母的 α-葡 聚糖酶 cDNA 克隆到毕赤酵母的表达载体 pPIC9K 中，再转化毕赤酵母菌株 GS115，经筛选得到高效 表达 α-葡聚糖酶的基因工程菌株 GS115-dex。已在 摇瓶水平对重组毕赤酵母的发酵条件进行了初步优 化： 甲醇诱导浓度 1.5%、 pH5.5～6.0、 装液量 25 mL 培养基／250 mL 三角瓶、 接种量 10％、 表面活性剂 0.02%、摇床转速 200 r/min，酶活达 73 U/mL[3]。 本文在摇瓶基础上，利用 5 L 发酵罐对重组毕 赤酵母产 α-葡聚糖酶甲醇流加条件作进一步优化。
毕 赤 酵 母 α- 葡 聚 糖 酶 基 因 工 程 菌 株 GS115-dex，由本实验室构建并保藏。
葡聚糖 T2000，购自 Pharmacia 公司；酪蛋白 水解物，购自 Sigma 公司；其他试剂为国产分析纯。
TG16W 微量高速离心机， 长沙平凡仪器仪表有 限公司；752N 紫外可见分光光度计，上海精密科学 仪器有限公司；SKY-200B 全温度培养振荡器，上海 苏坤实业有限公司；LDZS 型立式压力蒸汽灭菌器， 上海申安医疗器械厂；全自动 5 L 发酵罐，镇江格 瑞生物工程有限公司。
将甘油管工程菌接到 YPD 琼脂斜面上， 30℃培养 2～3 d；
从斜面挑适量菌，接到一级种子培养基，30℃、 250 r/ min 培养 14～16 h；
将一级种子按 10%接种量接到二级种子培养 基， 30℃、 250 r/ min 培养 14～16 h， OD600=15～20；
二级种子按 10%的接种量接到发酵培养基中。 在甲醇诱导前， 温度 29℃、 pH5.0、 溶氧 20%～30%； 在甲醇诱导表达阶段，温度 29℃、pH5.0、溶氧 10% 以上。
在已称量(G1)的离心管加入 1 mL 发酵液，在 12 000 r/ min 转速下离心 5 min，弃上清液并把管壁 的 水 分 吸 干 ， 准 确 称 量 (G2) ， 菌 体 湿 重 即 为 1000×(G2-G1)g/L。
取 l mL 发酵液稀释至 OD600=0.1～0.5， 置 752N 紫外可见分光光度计于波长 600nm 处以去离子水为 对照进行比色测定，OD600=读数×稀释倍数。
甘油被过量高碘酸氧化后，过剩的高碘酸及产 物碘酸与 KI 反应析出 I2，再用 Na2S2O3反滴定 I2， 计算可求得甘油含量。
甲醇在磷酸溶液中被高锰酸钾氧化生成甲醛， 过量高锰酸钾被草酸还原，再于草酸还原液中加亚 硫酸-品红使与氧化生成的甲醛起显色反应。以其显 色程度与标准溶液所显的颜色进行比色测定。
取 900 µL 2.0%的底物葡聚糖液，置于 45℃恒 温水浴中至少保温 5 min，加 100 µL 经 12000 r/min 离心 5 min 的发酵上清液(可以适当稀释)。 精确反应 10 min，立即加入 2 mL DNS 以终止反应，于沸水 浴 5 min，迅速将其冷却，用蒸馏水定容至 25 mL， 于 540 nm 下测定吸光值。 从标准曲线的回归方程求 得相对应的葡萄糖的量，并折算出酶活。
酶活定义：在上述条件下，每分钟从 α-葡聚糖 底物中释放出 1 µmol 还原糖所需的酶量为 1 个酶活 单位，以 U/mL 表示。
图 1：流加甘油，使菌体湿重达到 150 g/L 时开 始流加甲醇诱导表达 α--葡聚糖酶。可以看出：诱导 90 h 时，酶活达 201 U/mL，湿重为 349 g/L；发酵 总时间 144 h 时， 酶活达 221 U/mL， 菌体湿重为 370 g/L。
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图 1 菌体湿重 150 g/L 起始诱导对菌体湿重和酶活的影响 |
图 2：流加甘油，使菌体湿重达到 250 g/L 时开 始流加甲醇诱导表达 α--葡聚糖酶。可以看出：诱导 90 h 时，酶活达到 255 U/mL，菌体湿重为 445 g/L； 发酵总时间 144 h 时，酶活达到 260 U/mL，菌体湿 重为 451 g/L；
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图 2 菌体湿重 250 g/L 起始诱导对菌体湿重和酶活的影响 |
图 3：流加甘油，菌体湿重达到 350 g/L 时开始 流加甲醇诱导表达。可以看出：诱导 90 h 时，酶活 达到 249 U/mL，菌体湿重为 450 g/L；发酵总时间 144 h 时， 酶活达到 265 U/mL， 菌体湿重为 446 g/L。
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图 3 菌体湿重 350 g/L 起始诱导对菌体湿重和酶活的影响 |
由此可见，诱导 90 h 时以及总发酵时间 144 h 时，图 2 的酶活和菌体湿重均明显高于图 1，而与 图 3 相近。说明了在不同菌体量起始甲醇诱导对重组毕赤酵母表达外源蛋白的影响：起始诱导时菌体 量过低，没有足够的菌体参与分泌表达酶蛋白，因 此酶活较低；起始诱导时菌体量增加，参与分泌表 达酶蛋白的菌体也增加，因此酶活也增加；但起始 诱导菌体量达到一定程度后，继续增加菌体量，则 会由于菌体密度过大而影响营养和氧气的摄入，同 时菌体代谢产物对分泌表达酶蛋白的抑制作用也可 能增加。因此，起始诱导菌体量并不是越高越好。
图 1、图 2、图 3 的结果还表明，起始甲醇诱导 90 h 后，酶活力增长缓慢，考虑到发酵时间及成本， 诱导时间 90 h 为宜。这样不仅缩短了发酵时间，降 低了成本，而且也有利于后期纯化。
综上所述， 重组毕赤酵母诱导表达 α--葡聚糖酶 的起始菌体浓度 250 g/L、诱导时间 90 h 为宜。
一般来说，高密度发酵过程中，外源蛋白的表 达水平要比普通摇瓶高出几倍到几十倍，主要原因 是普通摇瓶发酵的供氧不足，影响了菌体的高密度 生长及表达。 因此毕赤酵母发酵过程中， 溶氧 （DO） 是一个非常重要的影响因素，图 4 和图 5 为甲醇诱 导阶段 DO 控制对菌体湿重和酶活的影响。
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图 4 甲醇诱导阶段 DO 控制在 10%～20%对菌体湿重和酶活的影响 |
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图 5 甲醇诱导阶段 DO 控制在 20%～40%对菌体湿重和酶活的影响 |
从图 4 和图 5 可以看出：菌体在接种后经过 12 h 的延滞期进入对数生长期，开始流加 50%甘油(含 PTM1 12 mL/L)。 随着菌体密度逐渐增加， 需氧量也 越来越大，这时通过加大通气量、提高搅拌速度、 增加罐压等方法来维持 DO。菌体湿重达到 250 g/L 时， 停止流甘油， 开始流加甲醇(含 12 PTM1 mL/L)， 进入甲醇诱导表达阶段。在甲醇诱导前几个小时， 菌体湿重几乎没有增加，这是因为重组毕赤酵母的 碳源从甘油变成甲醇时， 酵母需要一段时间来适应， 这段时间酵母对甲醇的吸收非常缓慢，细胞生长缓 慢。在图 4 中，随着培养时间的增加，菌体密度和 α-葡聚糖酶的活性都有所增加。诱导 90 h 时，菌体 湿重达到 449 g/L，酶活达到 280 U/mL，但随后酶 活增长趋于平缓。发酵总时间为 144 h 时，最终酶 活 296 U/mL，最终菌体湿重为 450 g/L。在图 5 中， 诱导 90 h 时，酶活达到 241 U/mL；发酵总时间为 144 h 时， 酶活达到 252 U/mL， 菌体湿重为 450 g/L。
结果表明：在甲醇诱导阶段，溶氧并非越高越 好，过高的溶氧反而不利于重组毕赤酵母表达 α-葡 聚糖酶，甲醇诱导阶段保持 10%～20%的溶氧更有 利于目的蛋白的表达。
在实验中，当菌体密度达到一定值时，开始流 加甲醇。作为甲醇利用型酵母，此时培养基中甲醇 既是维持菌体正常生长代谢的碳源，又是诱导物， 甲醇的流加速度很重要。前述图 4、图 5 中恒溶氧 甲醇流加策略时，甲醇残留基本上为 0，再进行以 下实验来探讨发酵液中甲醇残留量对重组毕赤酵母 产 α-葡聚糖酶的影响，甲醇残留量分别控制在 0.2%、0.5%、0.8%，图 6～图 8 为甲醇残留量对菌 体湿重和酶活的影响。
从图 6 可以看出，在甲醇诱导阶段，甲醇残留 控制维持 0.2%左右，诱导 90 h 时，酶活达到 258 U/mL， 菌体湿重达到 450 g/L， 发酵总时间 144 h 时， 酶活达到 273 U/mL，菌体湿重达到 471 g/L。从图 7 可以看出，甲醇残留控制维持 0.5%左右，诱导 90 h 时，酶活达到 199 U/mL，菌体湿重达到 450 g/L， 发酵总时间 144 h 时，酶活达到 220 U/mL，菌体湿 重达到 481 g/L。从图 8 可以看出，甲醇残留控制维 持 0.8%左右，诱导 90 h 时，酶活达到 185 U/mL， 菌体湿重达到 489g/L，发酵总时间 144 h 时，酶活 达到 193 U/mL，菌体湿重达到 503 g/L。
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图 6 甲醇残留量为 0.2%对菌体湿重和酶活的影响 |
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图 7 甲醇残留量为 0.5%对菌体湿重和酶活的影响 |
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图 8 甲醇残留量为 0.8%对菌体湿重和酶活的影响 |
对比图 6、图 7 与图 8，很明显，在甲醇残留 0.2%～0.8%时，随着甲醇残留量的增加，重组毕赤 酵母产 α-葡聚糖酶酶活力呈明显的下降趋势。这可 能是因为甲醇对毕赤酵母是一种有毒性的碳源及诱 导剂，它的残留量对酵母表达酶蛋白有很重要的作 用，甲醇残留量较低时，有利于提高酵母产目的蛋白的能力，但过高的甲醇残留量，会抑制酵母的正 常生长和代谢，当甲醇浓度高到一定程度时，甚至 有可能杀死酵母。
甲醇残留为 0.2%、诱导 90 h 时，酶活达到 258 U/mL，但比恒溶氧甲醇流加策略（甲醇残留为 0， DO 保持 10%～20%） 诱导 90 h 时的酶活(280 U/mL) 稍低，证明甲醇残留对酶蛋白的表达有害。
本文在摇瓶研究的基础之上，在 5 L 发酵罐上 探讨起始诱导菌体量、DO、甲醇残留等参数对重组 毕赤酵母生长与 α-葡聚糖酶表达的影响。 结果表明： 菌体湿重 250 g/L 时开始甲醇诱导， 诱导表达阶段溶 氧控制在 10%～20%、诱导时间 90 h 为宜，在此条 件下得到较理想的发酵效果， α-葡聚糖酶酶活达 330 U/mL。
| [1] | 梁达奉,曾练强,余林,等葡聚糖对制糖工业的影响及对策[J]甘蔗糖业, 2008(3):28-33. ( 1)
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| [2] | Efrain Rodriaguez Jimenez.The dextranase along sugar-making industry[J].Biotecnology Application,2005(22):20-27. (1)
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| [3] | 吴兆鹏,梁达奉,曾练强,等.毕赤酵母产α-葡聚糖酶发酵工艺的研究[J].粮油食品科技,2010,18(2):29-31. (1)
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| [4] | 章如安,杨晟.巴斯德毕赤酵母表达体系研究及进展[J].微生物学通报,2000(27):371-373. (1)
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| [5] | Fu W Y.Rapid determination method for glycerol with sodium periodate[J].Chemistry Word,1953(10):366-367. (1)
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