2011
2. 农业部甘蔗遗传改良重点实验室, 福建, 福州 350108
2. Key Laboratory of Genetics Improvement for Sugarcane, Ministry of Agriculture, Fuzhou 350108
甘蔗(Saccharum spp.)是温带和热带农作物， 是我国制糖的主要原料，所产蔗糖占全国食糖总量 的90% 以上。UGPase(UDP-glucose pyrophosphorylase, 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶)是糖代谢过程中一 个很重要的酶，在植物体中主要参与蔗糖代谢，它 能催化反应Glc-1-P＋UTP←→UDPG＋PPi [1]，而 UDPG 是高等植物中主要活化糖的形式，作为葡萄 糖基供体参与蔗糖、纤维素、半纤维素、海藻糖、 果胶质、胼胝质以及糖脂、糖蛋白的合成代谢[2,3]。 在生物体内各种基因的表达都会受到多种因素的影 响，UGPase 基因的表达受到Pi [4,5]、蔗糖[6,7,8]、低 温[9]、光[9]等因素的影响，这说明了在植物中调节 UGPase 基因表达的途径是多样化的。基因的表达 在不同层次上受不同调节因素的控制，如转录水 平、翻译水平及蛋白质加工水平的调控等，其中转 录水平的调控是主要的。位于基因5′上游的启动子 被认为是调节基因转录的主要因素，它与RNA 聚 合酶及反式作用因子的相互作用是转录调控的实 质，在某种程度上决定基因表达的时空顺序。
本课题组以甘蔗为材料，研究UGPase 基因的 克隆，拟在转录水平上阐明UGPase 的表达调控机 制。本研究首次克隆了UGPase 的全长包括上游启 动子调控区域。
甘蔗(FN95-1702)由福建省国家糖料改良中心 甘蔗种植基地提供。
大肠杆菌菌株DH5α由本实验室保存；pMD19- T Vector Kit，Ex Taq DNA 聚合酶，EcoRⅠ、pstⅠ、 XbaⅠ限制性内切酶，分子量Marker，LA PCRTM in vitro Cloning Kit 试剂盒均购自TaKaRa 公司；x 植物基 因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限 公司；胶回收试剂盒购自Promega 公司。
剪取甘蔗叶片，加液氮研磨成粉末，基因组 DNA 的提取使用Tiangen 公司的植物基因组DNA 提取试剂盒，具体步骤按说明书进行。
PCR 引物设计：根据NCBI 登录号为FJ536261 的甘蔗cDNA 序列，设计上下游引物：
UGP1：5'-CTCCGCTCGTCTGACATCTCCTCCC-3'；
UGP2：5'-GACGGCAAGCATCGCGCTTAAAGATC-3'。
PCR 反应体系(20 μL)：10×Ex Taq Buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，模板DNA(120 ng/μL) 1 μL， UGP1(20 μM) 0.4 μL，UGP2(20 μM) 0.4 μL，Ex Taq 聚合酶0.2 μL，ddH2O 11.4 μL。PCR 反应条件：预 变性94℃ 5min 后，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 5 min，30 个循环，72℃延伸7 min。
PCR 产物采用Promega 公司的胶回收试剂盒 进行回收，按照目的片段和Vector DNA 的摩尔比 为1：2～10 的比例16℃过夜连接，然后转化E. coli DH5α感受态。挑取在加有氨苄抗生素(Amp)的LB 平板上生长的菌落。菌液PCR 检测并碱法小量提 取质粒进行质粒PCR 检测。用primer premier 5.0 对已知甘蔗UGPase cDNA 限制性酶切位点进行分 析，并确定用EcoRⅠ对重组质粒进行酶切鉴定。 所获得阳性克隆命名为PMD-UD，序列测定由宝生 物工程(大连)有限公司完成。
按照 LA PCRTM in vitro Cloning Kit 说明书， 接头连接PCR 扩增未知的甘蔗UGPase 基因5'侧翼 序列。基因特异引物S1、S2 根据先前测定的甘蔗 UGPase 基因全长DNA 序列设计，接头及接头引物 C1、C2 由试剂盒提供：
引物S1：5'-TACAAAATGCCACAGCCCAGATAACTCA-3'；
引物S2：5'-ACCCACTCAGAAATCAGCAAAAATGGAAGG-3'；
引物C1：5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3'；
引物C2：5'-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'。
基因组DNA 的酶切消化。XbaⅠ过夜酶切基 因组DNA 体系：基因组DNA 5 μg，限制酶XbalⅠ 50 U，10×Buffer 5 μL，ddH2O 补足50 μL。乙醇 沉淀法回收核酸，溶解于10 μL 的灭菌蒸馏水。 接头连接DNA 库的建立。酶切产物与具相应 XbaⅠ粘性末端的Cassette 过夜连接体系：酶切产 物10 μL，XbaⅠCassette 2.5 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，10×Buffer 2 μL，ddH2O 补足20 μL。乙醇沉 淀法回收核酸，溶解于10 μL 的灭菌蒸馏水。
接头连接PCR。以接头连接DNA 为模板，进 行第1 轮反应(1st PCR)体系：10×LA PCR Buffer 1 μL，dNTP Mixture (2.5 mM ) 0.8 μL，引物S1、C1(10 μmol/L)各0.2 μL，模板DNA 1 μL，LA Taq (5 U/μL) 0.1 μL，ddH2O 补足10 μL。反应程序为：94℃ 3 min，94℃ 30 s，68℃ 4 min，循环30 轮。梯度稀 释1st PCR 反应液，以梯度稀释液为模板，引物S2、 C2 进行巢式PCR 扩增特异性目的DNA 片段，体 系、反应程序同上。
回收、连接及转化方法同1.2.2。
利用NCBI 的BLAST 在线分析工具对GenBank 数据库进行序列比对分析。采用DNAstar 软件进行序列的多重比较。采用PLACE、PlantCARE 等植 物转录因子数据库在线进行基础启动子区及调控元 件分析。
提取的甘蔗叶基因组DNA 经测定，其浓度为 250 ng/μL，260 nm/280 nm 光吸收比值在1.8～2.0 之间，带型完整，无降解，蛋白质污染小，符合要 求(见图1)。
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图1 蔗叶中提取的基因组DNA |
以甘蔗叶片基因组DNA 为模板，PCR 扩增出 约5.3 kb 的基因片段，条带单一、清晰(见图2)。PCR 产物回收后与pMD19-T 载体进行连接，转化大肠 杆菌DH5α，进行抗生素筛选，并通过菌液PCR、 质粒PCR 检测后用EcoRⅠ进行酶切鉴定，单酶切 后条带大小与理论值相符(见图3)。
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图2 PCR产物电泳结果 1：PCR产物；Marker.10000 bp |
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图3 重组质粒酶切鉴定 1：质粒；2：EcoRⅠ单酶切；Marker.10000 bp |
接头连接PCR 扩增出约0.8 kb 的基因片段(见 图4)。PCR 产物回收后与pMD19-T 载体进行连接， 转化大肠杆菌DH5α，进行抗生素筛选，并通过菌 液PCR、质粒PCR 检测后用EcoRⅠ/pstⅠ进行酶 切鉴定，双酶切后条带大小与理论值相符(图5)。
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图4 PCR产物电泳结果 1-3：以1st PCR产物分别稀释1倍、10倍、100倍产物 为模板的2nd PCR产物；Marker.2000 bp |
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图5 重组质粒酶切鉴定 1：质粒；2：EcoRⅠ/pstⅠ双酶切；Marker.5000 bp |
序列分析测序结果表明，克隆得到基因片段长为533bp，包含21 个外显子，20 个内含子。开放阅读框(ORF) 编码476 个氨基酸。将UGPase 基因核苷酸序列与 NCBI 中其它植物的UGPase 进行比对，与绿竹、 玉米、巨龙竹、水稻、大麦的相似性分别为：96％、 94％、93％、89％、87％。
克隆得到的甘蔗基因上游调控区域具有真核生 物启动子的一般特征，在位于转录起始位点上游位 置有TATA 框序列，且在-70 bp 附近存在共有序列 CAAT 区，即CAAT 盒。另外，通过启动子序列软 件推测该启动子区域含有某些元件，如LTR(低温 响应元件)、分生组织具体活化元件、光响应元件、 ABRE(脱落酸响应原件)。
在植物细胞的合成代谢中，UGPase 的作用与 其它酶(SS, SPS, Inv)相结合共同发挥作用[10]，因此 UGPase 基因的表达调控机制是复杂的，它在植物 的糖类代谢及植物的生长发育中有着重要的意义。 本文采用PCR 的手段得到UGPase DNA 全长，且 通过接头连接PCR 的方法克隆得到该基因的5'侧 翼序列，通过启动子序列分析软件推测在该序列上 存在TATA-box、CAAT-box 等特征元件，此外还预 测到大量与光响应有关的的顺式作用元件和一些与 组织发育相关的元件。本实验在获得UGPase 基因 的基础上，将对上游调控区域做进一步研究，希望 找到转录该基因的重要调控区域及关键元件，将为 在转录水平上阐明UGPase 基因的表达调控机制提 供可靠的理论依据。
| [1] | 祁超.Apocynaceae系细胞尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的纯化和表征[J]. 中国科学院研究生院学报,2004,2l(3):345-351. ( 1)
|
| [2] | Eimert K,Villand P,Kilian A et al.Cloning and characterization of several cDNAs for UDP-glucose pyrophosphorylase from barley(Hordeum vulgare)tissues[J]. Gene,1996,170:227-232. (1)
|
| [3] | 吴晓俊,刘涤,胡之璧.尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶[J]. 植物生理学通讯,2000,36(3):193. (1)
|
| [4] | Iwona Ciereszko,Henrik Johansson,Vaughan Hurry,et al.Phosphate status affects the gene expression,protein content and enzymatic activity of UDP-glucose pyrophosphorylase in wild-type and pho mutants of Arabidopsis[J]. Planta,2001,212:598-605. (1)
|
| [5] | Iwona Ciereszko,Leszek A Kleczkowski.Phos phate deficiency-dependent upregulation of UDP-glucose pyrophosphorylase genes is insensitive to ABA and ethylene status in Arabidopsis leaves[J]. Acta Physiologiae Plantarum,2006,28(5):387-393. (1)
|
| [6] | Iwona Ciereszko,Henrik Johansson,Leszek A kleczkowski.Sucrose and light regulation of a cold-inducible UDP-glucose pyrophosphorylase gene via a hexokinase-independent and abscisic acid-insensitive pathway in Arabidopsis[J]. Biochem.J,2001,354:67-72. (1)
|
| [7] | Akademisk Avhandling.Gene regulation of UDP-glucose synthesis and metabolism in plants[D],Umea Universitet,thesis of master degree,2003:30-31. (1)
|
| [8] | Spychalla JP,Scheffler BE,Sowokinos JR,et al.Cloning,antisense RNA inhibition and the coordinated expression of UDP-glucose pyrophosphorylase with starch biosynthetic genes in potato tubers[J]. Plant Physiol,1994,144:444-453. (1)
|
| [9] | Iwona Ciereszko,Henrik Johansson,Leszek A Kleczkowski.Interactive effects of phosphate deficiency,sucrose and light/dark conditions on gene expression of UDP-glucose pyrophosphorylase in Arabidopsis[J]. Journal of Plant Physiology,2005,162:343-353. (1)
|
| [10] | Leszek A Kleczkowski,Matt Geisler,Iwona Ciereszko,et al.UDP-Glucose Pyrophosphorylase.An old protein with new tricks[J]. Plant Physiology,2004,134:912-918. (1)
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