2009
2. 华南理工大学轻工与食品学院, 广州 510640
2. College of Light Industry and Food Sciences, SCUT, Guangzhou 510640
甘蔗制糖提汁过程的酶促褐变和酶促氧化是 直接影响在制品色值及最终产品质量的主要因 素。甘蔗原汁的颜色较浅，但在压榨提汁过程甘 蔗所含有的多元酚类在甘蔗多酚氧化酶（PPO）等 酶类作用下发生了酶促褐变，导致混合汁色泽明 显变深。PPO 还能催化蔗汁制品中内源性多酚物 质氧化成醌，再聚合成黑色素[1]。此外，甘蔗破 碎、压榨过程蔗料受铁制蔗刀、榨辊挤压摩擦， 设备中的铁以二价铁的形式溶入蔗汁中，在氧和 氧化酶的作用下，二价铁被迅速氧化成棕色的三 价铁，同时加速了甘蔗中多酚类与铁的反应而生 成深色物质。因此，研究甘蔗多酚氧化酶（PPO） 等酶类的提取及其酶学特性，寻求抑制甘蔗酶促 反应的方法，从源头上尽可能地减少制糖生产前 阶段的色素生成，对减轻糖汁澄清脱色的负担， 提高白糖产品质量具有重要的现实意义。
目前国内外对果蔬中的多酚氧化酶等酶类的 研究已有不少报导[2]，但却极少见有对甘蔗 PPO 提取与研究的报导。本文对甘蔗 PPO 的提取及部 分纯化展开研究，寻找甘蔗多酚氧化酶的最佳提 取条件，并就压榨预灰抑制酶促褐变的条件进行 了试验，为制糖提汁过程有效地抑制酶促褐变， 减少制糖过程色素生成提供一定的依据。
原料：台糖 22 号甘蔗，采自金光糖厂，榨出 的甘蔗原汁 pH 值为 5.25，固溶物含量 19.9°Bx； 磷酸氢二钠；磷酸二氢钾；邻苯二酚；聚乙烯吡 咯烷酮（PVPP） ；透析袋；
仪器设备：小型不锈钢榨汁机、UV-2802H 型 紫外可见分光光度计、BACKMANJ-20XPI 冷冻离心 机、SHZ-82 恒温振荡器、DELTA 320 pH 计。
将已冷藏在 4℃左右的甘蔗压榨原汁，加入 预冷的磷酸盐缓冲液和 PVPP，在冰浴中震荡 15 min，然后在 4000 r/min、4℃下离心 10 min，取 上清液，再次在冰浴中震荡 15 min 后，在 10000 r/min、4℃下离心 20min，上清液即为 PPO 粗酶 液[3]。
所提取的粗酶液中含有大量的杂质蛋白，要 得到较纯的酶液，必须将其进一步纯化。本实验 采用硫酸铵分级沉淀蛋白质方法进行提纯分离： 将固体硫酸铵缓慢添加到粗酶液中使其饱和度达 到35％， 加入过程缓慢搅拌避免局部饱和度过高， 在 4℃下静置 1h 后， 以 10000 r/min 离心 30 min， 保留上层清液，弃去沉淀；在上清液中继续缓慢 加入固体硫酸铵使饱和度达到 75％，4℃下静置 1h 后以 12000 r/min 离心 30 min，弃清液，保留 沉淀，将沉淀溶于适量的磷酸盐缓冲液，置于透 析袋中，在 pH6.2 磷酸盐缓冲液中，4℃条件下透 析 24 h 左右，透析过程更换缓冲液 4～5 次，得 PPO 透析酶液。将其置于－20℃冰柜中保存。
以 0.05 mol/L 邻苯二酚溶液(用磷酸盐缓冲 液配制，30℃保温)4.5 mL 为反应底物，置于试 管中，加入 0.5 mL 粗酶液或 PPO 透析酶液，组成 反应体系。迅速混合均匀后倾入 1 cm 比色皿，在 最大吸收波长下进行酶活力测定，从酶液加入起 开始计时，以蒸馏水代替酶液的反应体系作为参 比液。在该测定条件下，0.001 个单位的吸光度 变化值定义为一个酶活，活力曲线的直线部分作 为时间函数来衡量酶活力。在该条件下测定的酶 活力与酶液蛋白质含量相比即得酶比活力。
蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法，以牛 血清白蛋白作为测定的标准蛋白质[4]。
实验结果取 3 次平行实验的平均值。
按照 1.2.2 组成反应体系(pH6.2)，在 30℃ 下反应 30 min，将反应产物使用 UV-2802H 型紫 外-可见分光光度计在 300～700nm 下每隔 1nm 进 行吸收曲线扫描，确定最大吸收波长。
（1）PVPP 使用量的确定
使用 0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.2）作 为提取液 （提取液对原料甘蔗原汁的体积比为2） ， 分别加入 1％、2％、3％、4％、5％的 PVPP，观 察澄清情况，粗酶液于 0℃放置 24 h 后在 420nm 下测定吸光度，选取最适 PVPP 量。
（2）提取液对原料比例的确定
使用磷酸盐缓冲液为提取液，添加 2％的 PVPP，分别按缓冲液：蔗汁(体积比)为 0.6、1.0、 1.4、1.8、2.2、2.6 提取 PPO，测定粗酶液的吸 光度 A420 及酶活力，选取最佳的提取液比例。
（3）缓冲液 pH 对 PPO 提取效果的影响
分别配制 pH 为 4.6～8.2（以 0.4 为间隔） 的磷酸盐缓冲液，使用上述最佳提取条件提取甘 蔗 PPO，立即测定（0h）所得粗酶液的酶活力。 将粗酶液 0℃放置 12h 后再次测定酶活力。
分别配制 pH4.6～7.8(以 0.4 为间隔)的磷酸 盐缓冲液，以其作为溶剂配制 0.05 mol/L 邻苯二 酚溶液，研究 pH 对 PPO 活性的影响。
按照 1.2.4 的实验条件， 将不同 PVPP 用量下 所测得的吸光度值结果作图（图 1)。PVPP 是 N- 乙烯基吡咯烷酮（NVP）在特定条件下聚合而成的 能吸水溶胀但不溶于水的交联聚合物，对多酚具 有较强的吸附能力，使溶液得到澄清，可提高酶 的稳定性。由图 1 可知，添加 2％的 PVPP 即可有 效地防止由于底物的自动氧化引起的褐变，并且 在 0℃下放置 24 h 后粗酶液仍能保持澄清。因此 后续实验中选取 2％作为 PPO 提取过程 PVPP 的加 入量。
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图 1 PVPP 用量与粗酶液吸光度的关系 |
按照 1.2.4 的实验条件，以不同液料比提取 PPO 后在室温下测定酶活力，将结果列于表 1。从 结果可知，随着缓冲液使用量的增大，酶活力逐 渐降低，说明比例为 0.6 时已足够将蔗汁中的酶 溶出，再增大缓冲液使用量也不能引起酶活力升 高。其原因之一是提取液比例增加使 PPO 的浓度 降低。综合比较溶液的澄清效果与酶活力，选取 1.0 为提取过程提取液与原料的较佳比例。
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表 1 提取液与原料体积比对提取效果的影响 |
缓冲液 pH 对 PPO 提取效果的影响结果如图 2 所示。由图 2 可见，提高缓冲液的 pH 值，粗酶液 酶活力呈上升趋势。但 0℃放置 12h 后，pH 大于 6.2 时酶活力随缓冲液 pH 值的升高而降低。 因此， 由 PPO 的抽提效率和稳定性两方面综合考虑，选 取 pH6.2 的磷酸盐缓冲液作为提取缓冲液。
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图 2 pH 对 PPO 提取效果的影响 |
在波长 300～700nm 下，每隔 1nm 扫描甘蔗 PPO 催化邻苯二酚的反应产物的光密度，得甘蔗 PPO 酶促反应产物紫外吸收光谱图（图 3） ，可知 反应产物在 410nm 有最大吸收峰，故选取该波长 作为测定酶活力的波长。
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图 3 甘蔗 PPO 酶促反应产物紫外可见吸收光谱 |
按照 1.2.2 的实验条件， 用 PVPP 在缓冲液中 提取得粗酶液，再采用硫酸铵分级沉淀及透析的 方法得到纯化酶液，结果列于表 2 中。从结果可 见经过分级盐析、透析，PPO 获得了一定程度的 纯化，纯化倍数为 2.51，活力回收为 34.9％。
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表 2 甘蔗 PPO 提取与部分纯化结果 |
试验了 pH 值对甘蔗 PPO 活力的影响， 实验结 果如图 4。在 pH 值在 4.6～6.2 时，PPO 活力随 pH 增大而上升，在 pH6.2 处活力最大，pH6.2～ 6.6 时甘蔗 PPO 仍可维持较高的活力， pH 大于 6.6 时，PPO 活力急剧下降。这一实验结果提示了在压榨过程调节蔗汁 pH可以控制甘蔗PPO活力从而 抑制其酶促褐变。提汁过程的酶促反应从甘蔗破 碎即开始， 而现行的预灰一般在混合汁箱才加入， 预灰 pH 值一般为 6.8～7.2[5]。为此，可提前预灰 并提高预灰pH值至大于7.5可有效减缓蔗汁酶促 褐变，从制糖源头上减少糖汁增色。
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图 4 pH 值对甘蔗 PPO 活力的影响 |
（1） 试验确定了甘蔗多酚氧化酶的最佳提取 参数为：甘蔗冷藏在 4℃左右，磷酸氢二钠-磷酸 二氢钾缓冲液 pH6.2，含 2％的 PVPP，按提取液 与原料比为 1.0。
（2）甘蔗原汁经抽提、离心、分级盐析、透 析后制得部分纯化的 PPO 酶液、 纯化倍数为 2.51， 活力回收为 34.9％。
（3） 以邻苯二酚为底物的甘蔗 PPO 酶促反应 产物的最大吸收波长为 410nm。
（4）提前预灰并提高预灰 pH 值至大于 7.5 可有效减缓蔗汁的酶促褐变，从生产源头上减少 色素的形成。
| [1] | 霍汉镇.现代制糖化学与工艺学[M]. 北京:化学工业出版社,2007:33-36. ( 1)
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| [2] | Mazzafera P,Robinson S P.Characterization of polyphenol oxidase in coffee[J]. Phytochemistry,2000,55(4):285-296. (1)
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| [3] | 陈石根,周润琦.酶学[M]. 上海:复旦大学出版社,2001:91-132. (2)
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| [4] | 韦平和.生物化学实验与指导[M]. 北京:中国医药科技出版社,2003:23-25. (1)
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| [5] | 陈维钧,许斯欣.甘蔗制糖原理与技术:蔗汁清净[M]. 北京:中国轻工业出版社,2001:93-135. (1)
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