2008
甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease, RSD)是一种种苗传播的细菌性病害，广泛发生于 世界各植蔗国和地区[1,2,3,4]。由于RSD 没有明显的 外部和内部症状，单从外观难以鉴定，加上病原 细菌特别小，难以分离、培养和检测，传统的诊 断方法准确性差，使得RSD 诊断极其困难，从而 导致病害经种茎传播蔓延而不为人所知，对甘蔗 生产危害极大。
甘蔗RSD 诊断技术经历了从内部症状观察→ 相差显微镜检查→免疫技术→PCR 快速检测4 个 阶段。我国在这方面的研究比较落后，诊断方法 以内部症状观察和相差显微镜检查为主，应用免 疫技术和PCR 检测RSD 还处于起步阶段。本文就 PCR 技术在甘蔗宿根矮化病检测中的应用情况进 行综述。
1984 年，Davis 等鉴定RSD 病原为一种寄居 木质部维管束的细菌，并根据其表型特征将病菌 命名为Clavibacter xyli subsp. Xyli (Cxx)[5]。 2000 年，Evtushenko 等应用分子生物学分析该 病菌的rRNA 基因，根据rRNA 基因的特点将病菌 命名为Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx)[6]。 目前这2 种命名均普遍被采用和认可。RSD 病原 菌菌体呈直或微弯的细长棒状，有的中部或一端 膨大，内有间体，菌体大小在0.12～0.5 μm× 0.1～10 μm 之间。除菌体微小外，RSD 病菌还 不易分离培养，且为革兰氏阳性杆状细菌，细胞 壁破壁较困难，增加了检测的难度[7]。
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是1983 年由美国PE-Cetus 公司的Kary Mullis 等发明，1985 年公开报道的一种体外核 酸扩增系统[8]。PCR 技术具有快速、灵敏、操作 简便等优点，已广泛应用于分子生物学、医学、 微生物学等领域，进行基因的克隆遗传分析和疾 病诊断等。
通过引物设计，PCR 能够特异性扩增某一目 的DNA 片段，因此，在病原微生物的检测上，它 比传统方法有优势。例如：PCR 检测生物体时不 需要培养，在混合培养物中不需要放射性标记， 具有极高的灵敏度和检测单个靶分子的潜力等 等。对于那些用常规方法研究较困难的植物病 害，如类病毒以及专性寄生病原菌的检测，PCR 技术的应用更显示出它的优越性。近10 多年来， PCR 技术在植物病害检测中得到了广泛应用。
近年不少学者对甘蔗RSD 分子检测技术进行 了研究，Pan 等[9]利用甘蔗宿根矮化病病原细菌 (Leifsonia xyli subsp. xyli，Lxx)的16S-23S 核糖体DNA ITS 区域设计了1 对Lxx(Cxx)特异 引物Lxx1/Lxx2，对21 个Lxx 样本进行PCR 检 测，获得大小为438 bp 的DNA 特异扩增片段， 且Lxx 培养细菌和感染Lxx 的蔗株的蔗汁均可作 为PCR 扩增模板。
邓展云等[10]采用巴西专家提供的方法，稍 加改进，对广西蔗区甘蔗RSD 进行PCR 检测。采 用引物组合为RSD33/RSD297，其DNA 特异扩增 带分子量为265 bp。结果显示：广西各蔗区甘 蔗主栽品种及其他大部分引进和自育品种(系)材 料均检出RSD 阳性，而经过热水处理和组培脱毒 健康种苗PCR 检测呈阴性。
Follon 等[11]以RSD33/RSD297 为第1 轮引 物，RST60/RST59 为第2 轮引物，利用巢式PCR 对首次在牙买加发现的疑似RSD 病症样本进行扩 增，得到特异性扩增片段。经过测序，显示其同 源性与Lxx 16S-23S 核糖体ITS 高度一致(99％～ 100％)。
沈万宽等[12]采用Pan 设计的Lxx 16S-23S rDNA 基因间隔区特异性引物，建立了甘蔗宿根 矮化病PCR 检测方法；同时对PCR 扩增的目的片 段核苷酸序列进行测定与分析。结果表明广东湛 江蔗区RSD 病菌16S-23S rDNA 基因间隔区核苷 酸序列与巴西、澳大利亚及美国路易斯安娜州RSD 株系基因组相应区段核苷酸同一率接近100％， 表现出高度同源。而与近缘的木质部赖氏杆菌狗 牙根变种(Leifsonia xyli subsp. Cynodontis，Lxc) 和形态上相近的马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis) 基因组 相应区段核苷酸同一率较低，存在明显的分化。
周凌云等[13]以甘蔗茎组织总DNA 为模板， 以16S rRNA 基因赖氏细菌属(Leifsonia)通用引 物为第1 轮引物、甘蔗宿根矮化病菌(Lxx)亚种 特异引物为第2 轮引物建立了Lxx 巢式PCR 检测 技术，并根据已报道的Lxx 巴西分离物基因组全 序列(GenBank 登录号AE016822.1)设计了扩增致 病相关基因片段的3 个引物对（P2、P3、P4）。 经多种组合进行了RCR 检验，筛选出2 个特异性 好、灵敏高的引物对，建立了Lxx 的多重PCR 检 测技术。克隆测序表明，PCR 产物与巴西分离物 基因组相应区段同一率为99％以上。
在上述甘蔗RSD 的分子检测研究中，提到了 2 种改良PCR 模式，即多重PCR 和巢式PCR。多 重PCR(Multiplex PCR，又称多重引物PCR 或复 合PCR)，是在同一PCR 反应体系里加入2 对或2 对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR 反 应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR 相同[14]。自1988 年Chamberlian 等[15]首次提出 这一概念以来，多重PCR 技术已被广泛应用于核 酸诊断的许多领域，包括基因敲除分析、突变和 多态性分析、定量分析及RNA 检测等。在感染性 疾病领域，多重PCR 技术已经显示出它的价值， 成为识别病毒、细菌、真菌和寄生虫的有效方法。 巢式PCR(Nested PCR)是又一种PCR 改良模式， 它由2 轮PCR 扩增和对应的2 套引物对所组成。 首先对靶DNA 进行第1 步扩增，然后从第1 次反 应产物中取出少量作为反应模板进行第2 次扩 增，第2 次PCR 引物与第1 次反应产物的序列互 补，第2 次PCR 扩增的产物即为目的产物[16]。 实验结果表明，在适合条件下，改良PCR 可以有 效的提高检测的特异性和灵敏度，使检测结果更 为可靠。
根据目前研究，RSD 检测常用的引物组合有 7 对，引物序列见表1。
 | 表1 RSD 病原菌检测引物组合 |
其中，L1/G1 为赖氏菌属16S rRNA 基因的 通用引物，具广谱性，故单独使用进行PCR 扩增 时特异性较差。Lxx1/Lxx2 是根据甘蔗宿根矮化 病病原细菌(Lxx)的16S-23S 核糖体DNA ITS 区 域专门设计的，特异性好，灵敏度较高。使用L1/G1 作为第1 轮引物，Lxx1/Lxx2 作为第2 轮引物对 RSD 疑似样本进行巢式PCR 扩增，可有效提高检 测效率。RSD33/RSD297 和RST60/RST59 亦是根 据Lxx 的16S-23S 核糖体ITS 序列设计，特异性 和灵敏度较好，可单独使用，也可配合使用进行 巢式PCR。P2、P3、P4 是根据Lxx 巴西分离物基 因组全序列（GenBank 登录号AE016822.1）设计 的扩增致病相关基因片段的3 组引物对。P2 预 期扩增莽草酸盐5-脱氢酶基因片段，大小1556 bp；P3 预期扩增DNA 促旋酶A 亚基基因片段， 大小452 bp；P4 预期扩增DNA 聚合酶Ⅲβ亚基 基因片段，大小497 bp。周凌云等[13]的实验结 果表明：P2 和P3 2 对引物能够从1 种甘蔗内生 菌DNA 中获得扩增产物，大小与设计产物差异不 明显，因而这2 对引物特异性不能满足检测要 求。另外，在较低退火温度(50℃)下，Lxx1/Lxx2 能够扩增甘蔗基因组中的一段DNA，特异性是有 条件的，所以该组引物用于PCR 检测时退火温度 不应低于54℃；在较高的退火温度下，Lxx1/Lxx2 扩增效率（即检测灵敏度）降低。Lxx1/Lxx2 与 L1/G1 配合进行巢式PCR，能够显著提高检测灵 敏度，但是巢式PCR 要经过2 次PCR 过程，增加 了检测的繁琐程度。P4 与Lxx1/Lxx2 能够形成 双重PCR 检测体系，这种检测技术理论上能够提 高检测的可靠性，但是P4 扩增对象是编码DNA 聚合酶Ⅲ亚基因片段，引物结合位点序列的保守 性尚不明确，即P4 存在漏检的可能性。此外， 双重PCR 体系进一步降低了Lxx1/Lxx2 引物检测 的灵敏度。
综合以上各种因素，结合云南省农科院甘蔗 所使用的L1/G1 和Lxx1/Lxx2 2 对引物的表现， 推荐下列RSD 的PCR 检测方案：①单对引物PCR： Lxx1/Lxx2 或RSD33/RSD297 单对引物组合。控 制好退火温度，保证检测的灵敏度。产物呈预期 单条电泳带的样品为阳性。②双重引物PCR： Lxx1/Lxx2 和P4 引物组合在较高退火温度下进 行双重PCR。产物呈预期2 条电泳带(438 bp，497 bp)的样品为阳性，预期单一电泳带或者无电泳 带的样品需要再经巢式PCR 验证。③巢式(嵌 套)PCR ： 第1 轮RSD33/RSD297 ， 第2 轮 RST60/RST59 ； 或第1 轮L1/G1 ， 第2 轮 Lxx1/Lxx2。第2 轮扩增呈预期单一电泳带的样 品为阳性。
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