2. 山东大学 微生物技术国家重点实验室, 济南, 250100
2. State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100
在化石能源渐趋枯竭, 以及在对可持续发展、 保护环境和发展循环经济的追求中,世界开始将 目光聚焦到以丰富的、可再生的纤维素为原料, 生产更加安全、环保和高性价比的能源,以期部 分替代化石能源和石化产品。用纤维质原料生产 乙醇是未来燃料乙醇的发展方向。目前,美国、 巴西等国已制定大力发展燃料乙醇的政策,利用 玉米、甘蔗和其它木质纤维素材料等生物质原料 生产乙醇。由于糖厂蔗渣原料比较集中,易于收 集和处理,因而,蔗渣生产燃料乙醇已成为国内 外研究的热点[1]。
目前,蔗渣等生物质纤维酒精生产工艺的生 产成本还不能达到有经济效益的水平。主要的技 术难题是纤维的预处理与酶解效率较低和缺少能 充分利用纤维水解液中各种糖类成分的、具有良 好工业生产性能的微生物发酵菌株[2]。在纤维素 原料水解液中,木糖的含量为 30%左右,是继葡 萄糖之后自然界中最丰富的糖分。促进木糖向乙 醇的生物转化是充分利用纤维素生物质、降低乙 醇生产成本的关键环节之一。酿酒酵母是传统的 乙醇生产工业菌株,具有易培养、乙醇耐受度高、 耐高糖浓度、耐发酵抑制剂能力较强及厌氧发酵 等优良性状,但是其不能利用木糖生产酒精。因 而,在酿酒酵母中构建木糖代谢途径是这一方向 的研究重点[3]。
AS2.1190 是甘蔗糖蜜酒精发酵的优良菌种, 适应性强、发酵性能稳定,成熟醪含酒分较高, 并且对营养分的要求不高。 本文以 AS2.1190 作为 出发菌株,在其中建立木糖代谢途径,并对工程 菌株 GZ4-127 进行初步酒精发酵研究。
酿酒酵母 AS2.1190 系广州甘蔗糖业研究所 保藏, 质粒 pYIMKP-xy127 系山东大学鲍晓明实验 室构建,其质粒物理图谱见图 1。
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图 1 质粒 pYIMKP-xy127 的物理图谱 |
限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶(上海博尚生 物技术公司, BioAsia), 质粒小量提取试剂盒 (朋 远生物技术有限公司) ,酵母粉、胰蛋白胨 (OXOID),其它化学试剂均为国产分析纯。
大肠杆菌用 LB 培养基,添加 50 µg/mL 氨苄 青霉素。酿酒酵母用 YPD 培养基,添加不同浓度 的 G418 用于筛选酵母转化子。 酒精发酵用培养基 胰蛋白胨(2%),酵母粉(1%),葡萄糖(5%),使 用前加入 10%的木糖。
常规分子生物学操作参照文献和试剂公司提 供的操作手册进行[4,5]。
酿酒酵母转化采用 LiAc 完整细胞转化法[6], 酿酒酵母转化液涂布于含 G418 的 YPD 培养基上, 筛选转化子。
发酵条件:将活化的种子液按 10%(v/v)的 接种量分别接种于含 100 mL 发酵培养基的 500 mL 三角瓶中,30℃厌氧发酵。
菌体浓度测定:将菌液适当稀释后在 600 nm 下测定吸光度值,即 OD600。
发酵液样品经0.45 µm醋酸纤维滤膜过滤后, 用高效液相层析(HPLC)分析其中葡萄糖、木糖、 木糖醇、乙醇含量。层析柱用 Amine HPX-87H (Bio-Rad,USA )离子交换柱,流动相为 5 mmol/L H2SO4,流速 0.4 mL/min,柱温 55℃。用折光检测 仪 RID-10A(Shimadzu,Japan)进行检测。
制备质粒 pYIMKP-xy127 以后, 用限制性内切 酶 HpaⅠ对其进行线性化,结果见图 2。图中可以 看出,含有木糖代谢相关基因的整合型质粒 pYIMKP-xy127 已经线性化,无需纯化过程,直接 进行酵母转化。
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图 2 质粒 pYIMKP-xy127 的制备与 HpaⅠ酶切电泳照图 1,3-1kb DNA marker; 2-质粒 pYIMKP-xy127 的 HpaⅠ酶切产物; 4-质粒 pYIMKP-xy127 |
经 HpaⅠ线性化的重组质粒 pYIMKP-xy127, 以 LiAc 法转化糖蜜酿酒酵母工业菌株 AS2.1190, 转化液在含 G418(400 µg/mL)的 YPD 平板上得到 转化子。随机挑取 3 个转化子,提取染色体基因 组 DNA,利用扩增木糖还原酶基因(XYL1)的引 物进行 PCR 验证(扩增引物和反应条件未列出) 。 结果显示, 均扩增得到出发菌株 AS2.1190 基因组 没有的 XYL1 基因条带(见图 3) ,表明外源木糖 代谢相关基因整合到酵母基因组上。
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图 3 工业糖蜜酿酒酵母重组菌株的 PCR 鉴定 1-1Kb DNA marker; 2~7-不同模板进行 PCR 扩增的产物; 2,5-质粒 pYMIKP-xy127; 3-无模板; 4-1 号转化子基因组 DNA; 6-2 号转化子基因组 DNA; 7-3 号转化子基因组 DNA |
选取在选择平板上菌落比较大的 2 号转化子 命名为 GZ4-127,以 10%(v/v)的种子液接种, 厌氧条件下进行酒精发酵试验,以 OD600检测菌体 生长,HPLC 分析发酵产物,结果见图 4。
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图 4 酒精发酵生长曲线和产物分析 |
由图 4(A)可以看出,2 株菌表现出相似的生 长规律,20 h 基本上达到稳定期,菌体浓度 OD600 均能达到 20。生长曲线显示:工程菌株 GZ4-127 的 生 长 状 况 较 好 , 其 菌 体 浓 度 比 出 发 菌 株 AS2.1190 高 5%左右。
由图 4(B)、(C)可以看出,2 株菌都在短时间 内将葡萄糖消耗殆尽,同时伴随乙醇的产生达到 高峰,紧接着木糖开始被消耗。产物分析曲线显 示: 工程菌株 GZ4-127 比出发菌株 AS2.1190 的木 糖消耗提高 2 倍,酒精产率提高 12%,并伴随着 大量木糖醇的产生。
综上所述,工程菌 GZ4-127 的生长状况、木 糖消耗、 酒精产率都比出发菌 AS2.1190 有很大的提高。说明木糖代谢相关基因已经成功整合进入 AS2.1190 的基因组, 并且得到活性表达; GZ4-127 已经能够发酵木糖生产乙醇。
纤维质原料生产燃料乙醇的限制性因素是纤维素水解的成本和有效的木糖发酵菌株。由于木 质纤维素水解物本身的特性,对酒精发酵菌株要 求很高,比如:高乙醇产率、利用木糖生产酒精、 对糠醛等毒性物质有一定的抗性等。本工作构建 的工程菌株 GZ4-127 能够利用木糖生产乙醇,但 对木糖的利用过程中,乙醇的产率很低,远远不 能满足要求。今后,还需将分子育种与传统育种 相结合,针对 GZ4-127 展开驯化、诱变、细胞融 合等研究工作,以期获得满足纤维质原料生产乙 醇的商业化菌株。
[1] | 李奇伟,戚荣,张远平.能源甘蔗生产燃料乙醇的发展前景[J]. 甘蔗糖业,2004(5):29-33. (![]() |
[2] | 田沈,徐鑫,杨秀山,等.木质纤维素乙醇发酵研究进展[J]. 农业工程学报,2006,22(增刊1):221-224. (![]() |
[3] | 沈煜,王颖,鲍晓明,等.酿酒酵母木糖发酵酒精途径工程的研究进展[J]. 生物工程学报,2003(195):636-640. (![]() |
[4] | FREDERICK M A,ROBERT E K,SEIDMAN J G,et al.精编分子生物学实验指南[M]. 颜子颖等,译.北京:科学出版社,1998. (![]() |
[5] | SAMBROOK J,RUSSELL D W.分子克隆试验指南:第3版[M].黄培堂等,译.北京:科学出版社,2002. (![]() |
[6] | 王颖,鲍晓明,杨国梁,等.工业酵母菌住转化体系的建立[J]. 工业微生物,2004,3(1):6-11. (![]() |