甘蔗糖业  2004 Issue (5): 23-25   PDF    
引用本文
李瑞美, 吴水金, 吴松海, 林一心. 不同基因型甘蔗愈伤组织培养研究[J]. 甘蔗糖业, 2004,(5): 23-25.  
Li Ruimei, Wu Shuijin, Wu Songhai, Lin Yixin. Studies on the Callus Culture of Different Sugarcane Genotypes[J]. Sugarcane and Canesugar, 2004,(5): 23-25.  
不同基因型甘蔗愈伤组织培养研究
李瑞美1, 吴水金2, 吴松海2, 林一心2    
福建省农科院甘蔗研究所, 福建 363005
摘要：以果蔗拔地拉、广东黄皮果蔗及糖蔗闽糖92-649、ROC16、ROC25为试验材料,研究不同预处理、蔗糖浓度及不同激素水平对甘蔗愈伤组织的诱导、分化的影响。结果表明以PVP水溶液浸泡外植体,可使平均褐化率由43.1%减低到22.4%,愈伤组织诱导率由61.04%提高到71.25%;添加50 g/L的蔗糖浓度可促进愈伤组织的诱导及分化。
关键词： 甘蔗     基因型     愈伤组织     蔗糖用量     激素    
Studies on the Callus Culture of Different Sugarcane Genotypes
Li Ruimei1, Wu Shuijin2, Wu Songhai2, Lin Yixin2    
Research Institute of Sugarcane, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fujian 363005
Abstract: ied.The results showed that ratios of explant browning were decreased from 43.1%to 22.4%,and the ratios of callus inducing were raised from 61.04%to 71.25%.After the explants soaked in polyvinylpyrrolidone (PVP),the mass-concentration of 50 g/L sucrose was suitable for callus inducing and callus plantlets.
Key words: Sugarcane     Genotype     Callus     Dosage of sucrose     Hormone    

甘蔗(S. officinarum L.)首块愈伤组织 于1961年获得，1969年Heinz Barba和Nickell 从愈伤组织得到完整植株。近几十年来，甘蔗的 组培技术得到突飞猛进的发展，随着分子生物技 术发展的不断深人，甘蔗愈伤组织作为转基因工 程中的受体材料，其质量的优劣对遗传转化起着 重要的影响。本试验以几个不同基因型甘蔗为材 料，探索不同蔗糖用量及不同激素水平的组培效 果，为不同甘蔗基因型利用组织培养方法加快种 苗繁殖及为甘蔗遗传转化提供高质量受体提供更 合适的组培技术。

1 材料和方法

选用黑皮果蔗拔地拉、广东黄皮果蔗及糖蔗 闽糖92-649、 ROC16、 ROC25为参试材料。以11 月中旬取幼嫩叶鞘为外植体，以洗衣粉刷洗表面 污垢，再以清水冲洗，用干净纱布吸干表面水分， 在无菌条件下以75%乙醇表面喷雾，过1~2 min，剥开表面叶片，再以75%乙醇表面喷雾， 随后，逐层剥离，取心叶切成2 mm X 3 mm大小 的方块，预处理以200 mg/L PVP溶液浸泡20 min 后再接人培养基MS + 2, 4-D 2. 0 mg/L中，对照 处理直接接人诱导愈伤的培养基中，暗培养，保 持温度26℃左右。

诱导愈伤组织的培养基为:M1-MS + 2, 4-D 0.5 mg/L; M2-MS+2, 4-D 2. 0 mg/L; M3-MS+ 2, 4-D 2. 5 mg/L; M4-MS+2, 4-D 3. 0 mg/1; M5-MS +2, 4-D 3. 5 mg/L, M6-MS+2, 4-D 14. 0 mg/L 均以蔗糖为碳源，质量分数为3%，琼脂质量分 数为10%，pH 5. 8，暗培养。

分化培养基为:M-MS + 2, 4-D 2. 0 mg/L + 6-BA1 mg/L。以蔗糖为碳源，质量分数分别为30 g/L、 50 g/L、 70 g/L，琼脂质量分数为10%, pH 5. 8。光照培养，光强1000~15001x。

外植体接人培养基后，每隔3天观察记录， 褐化以褐化物渗人到培养基内为标准;诱导率和 分化率以出愈的心叶片数或分化的愈伤块数占接 种时的总片数或总块数的百分率表示。

2 结果与分析
2.1 预处理对外植体褐化和愈伤组织诱导的影响

表1是5个基因型的心叶接种到诱导培养基 后外植体褐化率和愈伤组织的诱导率，从表中可 见，在PVP处理条件下，外植体褐化最严重的为 拔地拉，褐化率为43.1%;褐化较轻的为闽糖 92-649，褐化率仅为9.6%; 5个品种平均褐化 率为22.4。而在未用PVP232浸泡的对照中， 最高褐化率仍为拔地拉，达到52.8%; 5个品种 平均褐化率是28.4%。由此可以看出，不同基 因型甘蔗的外植体褐化率用PVP232预处理比对 照明显降低。从表中还可看出，不同基因型甘蔗 褐变存在明显差异，在处理条件下，拔地拉的褐 化率是闽糖92-649、 ROC25的4. 48倍，ROC15 的4. 2倍;在对照条件下，拔地拉的褐化率是闽 糖92-649的5. 1倍、ROC25的4. 03倍，ROC15 的2. 8倍。从表中还可看出，PVP处理对闽糖 92-649效果不太明显，与对照相比仅相差 0.7%。表明不同基因型甘蔗对酚类氧化所引起 褐化反应具有不同的承受能力。

表1 不同预处理对外植体褐化和愈伤组织诱导的影响

从表1还可看到，在对照条件下，愈伤组织 的最低诱导率为37. 5，最高诱导率也仅为 68. 1%，外植体经PVP232预处理后，5个甘蔗 基因型的愈伤组织诱导率都有不同程度的提高， 增幅在4.7%~28.1%之间，其中拔地拉增加幅 度最大;对照条件下5个基因型的愈伤组织平均 诱导率为61. 04，在处理中后提高到71. 26 %。 说明预处理对提高诱导率效果明显。

2.2 不同激素水平对愈伤组织诱导的影响

植物激素在植物离体培养中起着重要的作 用，对愈伤组织的诱导和器官的分化有着直接的 影响，从表2中可看出，不同激素水平对外植体 愈伤组织的诱导存在较大的差异，在外植体接人 培养基30天后，各品种的外植体均膨胀几倍， 边缘出现颗粒状、淡黄或黄白、质地均一的胚性 愈伤或浅黄色糊状的愈伤组织。不同激素配比的 诱导率不同，其中M2. M3诱导的效果较好，诱 导率为85%左右，且胚性愈伤的比例高;其它 的虽诱导出愈伤组织，但易形成浅黄色糊状的愈 伤组织。观察得知，在同一激素水平下，不同基 因型甘蔗所形成的愈伤组织类型差异较大，如闽 糖92-649所诱导出的颗粒状、淡黄的胚性愈伤 多，而ROC16、 ROC25所诱导出的愈伤组织多为 浅黄色糊状的愈伤组织。

表2 不同激素水平对愈伤组织诱导的影响
2.3 不同蔗糖用量对外植体愈伤组织诱导和分化 的影响

试验观察到，随着蔗糖用量的不同，愈伤组 织的诱导及分化亦存在差异。在蔗糖浓度为10~ 50 g/L范围内，愈伤组织的诱导及分化率随着 蔗糖用量的增加而增加，但外植体的褐化亦逐渐 加重。当蔗糖浓度达到70 g/L时，由于褐化过 于严重，愈伤组织的诱导及分化率下降。从表中 可看出，在蔗糖浓度为50 g/L时，诸品种的诱 导及分化率达到最高，5个品种的平均诱导率为 79.4，分化率为75.4%;比蔗糖浓度为10 g/L 时的诱导率增加14%，分化率增加11.4;比 蔗糖浓度为70 g/L时的诱导率增加6. 6，分 化率增加0. 8;说明在愈伤组织的诱导及分化 过程中，较合适的蔗糖用量为50 g/L。此外， 从表中可知，在不同蔗糖浓度下，拔地拉的分化 能力均强于其它品种，这显示出不同品种基因型 差异。

表3 不同蔗糖用量对外植体愈伤组织诱导和分化的影响
3 结论与讨论

为减少组织培养中的褐化现象，有人在培养 基中加人抗氧化剂和吸附剂，但吸附剂抑制褐 化，有副作用，即吸附剂在吸附酚类物质的同时， 也会吸附培养基中的生长调节剂。本试验尝试 用PVP水溶液浸泡外植体，使5个基因型的平均 褐化率由43. 1%减低到22.4%;而且使得5个 基因型的平均愈伤组织诱导率由61. 04%提高到 71. 25%。这充分说明，在接种前用PVP水溶液 浸泡外植体能有效抑制褐化发生，同时能大大提 高心叶组织的愈伤形成能力。植物激素对愈伤组 织的诱导和器官的分化有着直接的影响，不同激 素水平对外植体愈伤组织的诱导存在较大的差 异。蔗糖是植物离体培养中的碳素来源和能量物 质，在激素水平相同的情况下，采用50 g/L的 蔗糖浓度，可提高愈伤组织的的诱导率及分化 率。

本试验结果还表明，不同基因型甘蔗心叶对 酚类氧化所引起褐化反应具有不同的承受能力; 且由于基因型不同，其心叶愈伤组织的诱导率、 分化能力也存在较大的差异。因此，在甘蔗组织 培养过程中，为提高愈伤组织的诱导率、分化率， 在同一基本培养基的基础上，应根据不同基因型 甘蔗对激素或相关成分进行适当调整。