2003
2. 广西职业技术学院 南宁明阳 530227
2. Gangxi Vocational Technology College, Mingyang, Nanning 530227
衣康酸(Itaconic Acid)已经广泛应用于 制备合成树脂、合成纤维、塑料、橡胶、离子交 换剂、表面粘结剂、锅炉除垢剂、润滑油添加剂、 无毒包装材料、除草剂等，最近又不断开发出新 的用途，如应用于合成乳胶涂层以提高纸张表面 光滑度和机械强度，改善纸张吸墨性能，应用于 优质喷墨制造以及新型阻燃材料、新型护发光亮 剂等[1,2]。
衣康酸的生产和应用研究过去主要集中在 日、美等少数发达国家，上世纪80年代以来我 国在此方面也逐渐取得了较大进展，目前已有多 家厂生产，但其中许多存在着产酸率偏低、转化 率不高、发酵周期长、菌种稳定性差的问题，整 体水平与国外仍有较大差距。从有机酸行业报表 获悉，1999年平均产酸率为5.6%。在我国北方 主要采用玉米淀粉生产衣康酸，我国南方以及国 外大多数地方则采用蔗糖为原料。我们以土曲霉 Asperglllus terreus NRRL 1960为出发菌株， 通过物理、化学诱变结合的方法选育以蔗糖为原 料直接发酵衣康酸的高产菌株，对于广西蔗糖深 加工生产高附加值产品有重要意义。
土曲霉Asperglllus terreus NRRL 1960，来 自美国北方农业研究所培养物保藏中心。
HYG-2型回转式恒温调速摇床柜，上海新星 自动化设备控制成套厂;10L全自动控制发酵 罐，德国贝朗公司。
麦芽汁40mL/L,葡萄糖2%，蛋白陈0.1%,琼脂2%,pH自然。
蔗糖7%，MgS04×7H2O 0.4%，(NH4)2S04 0.4%，生长促进剂0.1%~0.6%，琼脂2%,嗅甲 酚绿溶液0.01%，调pH4.0~4.5。
蔗糖(或葡萄糖)10%, MgS04×7H2O 0.1%, NH4N03 0.25%，生长促进剂0.1%~0.6%，其他微量 元素适量，调pH3.0~3.5。
用生理盐水制成单抱子悬浮液，分别用Co60 源以20.64~30.96剂量单位(C/kg)照射。
用生理盐水制备单抱子悬浮液，在直径5cm 的小培养皿中加约5mL，在15cm距离下用60W紫外灯照射30~90s，在黑暗条件下静置1天， 之后取出稀释涂平皿。
光敏试剂8-MOP诱变:用生理盐水制成单抱 子悬浮液，加人适量光敏试剂8-MOP无水乙醇溶 液，混合均匀，室温暗处摇动吸收1~4h，然后 用黑光灯在20cm距离振荡照射10~30min。
将诱变处理过的抱子液稀释涂布到筛选平板 培养基上，30~35℃培养3~7天，挑取黄色产酸 圈与菌落直径比大的菌株，进行摇瓶发酵试验，选 取产酸率高的菌株进一步纯化和育种。
在摇瓶和10L全自动控制发酵罐中进行，接 种量6%~10%，培养温度30~35℃，转速200~ 250r/min，发酵时间3~4天。
定性采用纸层析法，定量采用嗅法滴定酸值 (Friedkin法)[3]。
我们采用多种理化方法选育衣康酸高产菌， 诱变谱系见图1。
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图1 诱变谱系 |
不同诱变剂及不同剂量对衣康酸高产菌的选 育效果有较大影响。表1对不同诱变剂的诱变效 果进行了比较。从表1可以看出，在较低的诱变 致死率下，虽然筛选工作量较大，但容易得到正变 幅度大的突变株。对于衣康酸产生菌，用亚硝基 肌、8-MOP诱变的效果很好，而且在产酸率较高的情况下，8-MOP仍然具有较好的正向诱导作用。
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表1 不同诱变剂的诱变效果 |
我们对T730与NRRL1960进行了相同条件下 的摇瓶发酵批试验比较，结果见表2。从结果可 知，T730比出发菌株NRRL1960的产酸率提高了 247，糖酸转化率达到66%，性能大大提高。
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表2 土曲霉T730与NRRL 1960对比 |
我们进行了T730在10 L全自动控制发酵罐 中的放大批试验，结果见表3。从结果可知，T730 在10L发酵罐中产酸水平能保持稳定，而且由于 通气、溶氧等条件的改善，发酵时间比在摇瓶中 明显缩短，只需要66h左右。因此T730具有很 好的生产应用潜力。
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表3 下730在10 L发酵罐中的批试验结果 |
通过上述育种工作，我们得到了多株衣康酸 高产菌，其中T730在含蔗糖10%的培养基中，在 10升发酵罐中培养约66h，多批发酵平均产酸率 高达6.6%，糖酸转化率达66%，远远超过出发菌 株NRRL1960的水平[4,5]，具有很大的生产应用潜力。若将来能转为工业化生产，将为蔗糖深加工 生产高附加值产品提供一条良好途径。
实验还表明，我们采取的诱变手段是非常有 效的。特别是采用了国内外比较少用的8-MOP处 理方法，在产酸率较高的情况下最大正变幅度仍 然能提高25%~51%，效果显著。NTG处理方法 条件剧烈，突变率高，较为常用，但是在产率高的情况下容易产生负变。根据我们实验观察，8-MOP处理 衣康酸产生菌的负变率要低于NTG处理，操作条 件也相对温和，安全性相对较高，这说明8-MOP 处理法很值得在微生物育种工作中使用，并且有 待深入研究。
| [1] | 杨漓,杨辉.衣康酸应用研究进展.氨基酸与生物资源,1999(21):99～101 ( 1)
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| [2] | 孙智凤等.衣康酸应用开发新进展.工业微生物,2002,32(3):51～55 (1)
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| [3] | 金其荣等.有机酸发酵工艺学.北京:中国轻工业出版社,1994 (2)
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| [4] | Lockwood, L. B. et al. Arch. Biochem.,1946(10): 365 (1)
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| [5] | Nelson, G. E. N. Ind. Eng. Chem., 1952 (44) (1)
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