黑色素瘤是起源于皮肤黑色素细胞的高度侵袭性恶性肿瘤，其发病率在全球范围内呈逐年上升趋势^[1]。小鼠黑色素瘤细胞系B16F10是一类经典的小鼠黑色素瘤研究模型。该细胞系起源于C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤细胞，是经过多次体内筛选获得的高转移性亚系^[2-3]。B16F10细胞不仅具备增殖迅速、易于体外培养的特性，更因其高转移潜能及保留黑色素合成能力的特点，被广泛应用于肿瘤转移、免疫逃逸、药物筛选等领域的研究^[2-3]。

目前，白癜风的临床管理仍面临严峻挑战。常规治疗方法如局部外用糖皮质激素、钙调神经磷酸酶抑制剂以及紫外线光疗，虽对部分患者有效，但存在应答率不一致、易复发、长期应用可能引起皮肤萎缩及毛细血管扩张等局限性。在进展期患者中，系统免疫抑制剂的运用则需权衡其全身性不良反应^[4]。近年来，基于黑色素细胞移植的细胞疗法为稳定期白癜风患者带来了希望，但其推广应用仍面临细胞来源短缺、体外扩增稳定性不足、成本较高以及存在潜在的安全性风险（如移植细胞发生恶性转化的可能性）等挑战^[5]。因此，开发一种兼具高效、微创、高安全性且能针对白癜风多环节病理机制的新型治疗策略已成为该领域的迫切需求。

外泌体（exosome，EXO）是一类由细胞分泌的微小囊泡，在细胞间通信中起着重要作用，能够携带蛋白质、脂质、mRNA、miRNA等生物分子，从而影响受体细胞的功能^[6]。基于EXO的无细胞治疗技术凭借其天然的生物相容性、低免疫原性、精准的靶向递送能力以及可工程化修饰的特性，在疾病诊断与治疗领域展现出巨大的临床转化潜力，被视为极具前景的天然药物递送系统。多项临床前及早期临床研究已初步证实其安全性及有效性。例如，间充质干细胞来源的EXO在皮肤再生医学中进展显著，其通过递送丰富的功能蛋白与核酸可有效调控局部免疫微环境、抑制过度炎症反应、促进成纤维细胞增殖与胶原合成，已在难治性创面愈合（如糖尿病足溃疡）及皮肤年轻化等领域展现出良好的应用潜力^[7-11]。EXO有望为白癜风治疗提供一种全新的解决方案。

目前EXO相关研究多聚焦于正常或干细胞来源的EXO，对于其他特殊细胞来源（如肿瘤细胞）EXO的治疗探索尚处于起步阶段。这类EXO虽在其天然状态下参与肿瘤进程，但其独特的分子载荷谱（如富含特定功能蛋白或信号通路调控因子）可能为某些特定疾病的治疗提供“以病治病”的新策略^[12-13]。如何精准驾驭其生物学特性并将其转化为安全可控的治疗制剂，已成为拓展EXO临床应用的前沿方向。本研究旨在探索B16F10细胞来源EXO（B16F10-EXO）在白癜风治疗中的潜力。

当前肿瘤细胞来源EXO的研究主要集中于肿瘤诊断标志物开发及作为治疗干预靶点（如作为药物递送载体^[14]或免疫调节介质^{[1, 15]}），其自身作为独立治疗性生物制剂的直接应用研究仍处于起步阶段，尚未见系统性探索。基于前期文献调研提示，B16F10-EXO中富集的黑色素合成相关蛋白[如酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）^[16]、酪氨酸酶相关蛋白（tyrosinase-related protein，TYRP）1^[17]/TYRP2等]及具有抗氧化活性的功能蛋白（如超氧化物歧化酶^[18-19]、谷胱甘肽过氧化物酶^[19]等）可能通过调节黑色素代谢、抑制氧化应激等途径参与疾病调控，具备潜在治疗价值。基于此科学假设，本研究开展了B16F10-EXO的分离提取与质量鉴定工作，并运用蛋白质组学技术（包括液相色谱-串联质谱非标记定量分析^[6]、生物信息学注释等）对其蛋白质组特征进行全面解析，明确其核心成分谱；进一步结合京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析等方法，预测其主要成分的潜在生物学功能^[20]，为后续验证其治疗应用提供分子层面的理论依据。

1   材料和方法

1.1   实验动物及细胞

6~8周龄、雄性C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0006]，饲养于温度为（22±2）℃、湿度为（50±10）%、12 h光照/12 h黑暗交替的屏障环境中，自由摄食、饮水。实验前适应性饲养3 d。源于C57BL/6小鼠的黑色素瘤细胞系B16F10购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2   体内成瘤实验

取对数生长期的B16F10细胞，胰酶消化后离心收集细胞，用预冷的无菌PBS调整细胞密度至2.5×10⁵个/100 μL。采用异氟烷吸入麻醉（3%诱导，1.5%维持）后将C57BL/6小鼠固定于操作板，右侧背部剃毛并用碘伏消毒。用1 mL无菌注射器抽取细胞悬液，沿小鼠背部皮下正中线右侧1 cm处进针，回抽无血后缓慢推注100 μL细胞悬液，拔针后轻压注射点至无渗液。接种后每日观察小鼠状态。接种后第12天再次以相同麻醉方案麻醉小鼠，沿原注射点切开皮肤，完整剥离肿瘤组织。实验结束后，处死小鼠并按动物伦理规范处理。

1.3   B16F10-EXO的提取与纯化

首先，将初始样品于4 ℃环境下3 000×g离心10 min，以去除细胞培养上清中的细胞碎片及其他大颗粒杂质，小心吸取上清液并转移至新的离心管中备用。随后，加入EXO提取试剂（EXO提取纯化试剂盒购自上海宇玫博生物科技有限公司），按20∶5的比例（即每20 mL样品加入5 mL EXO提取试剂）混匀，通过涡旋振荡器充分混匀1 min；混合液于2~8 ℃静置2 h，使EXO在高盐环境下充分聚集。静置完成后，将离心管置于4 ℃环境下10 000×g离心60 min，弃去上清液后，沉淀即为富含EXO的粗品。将沉淀用100 μL预冷的PBS轻轻吹打至均匀悬浮，转移至新的1.5 mL离心管中，4 ℃环境下12 000×g离心2 min，去除残留的杂质，保留上清液（含高纯度EXO颗粒）。最终，将上述纯化后的EXO粗品转移至EXO纯化过滤柱的上室中，4 ℃环境下3 000×g离心10 min，通过亲和柱的筛分作用进一步去除非特异性结合的杂质，收集滤液，即为高纯度EXO颗粒。纯化后的EXO于－80 ℃低温冰箱保存，备用。

1.4   EXO纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）

从4 ℃冰箱中取出待测EXO样品，置于冰上缓慢溶解；待完全溶解后，采用超声破碎仪（频率20 kHz，功率150 W，占空比30%）对样品进行分散处理，设置超声模式为“工作5 s-间隔5 s”，重复3次，以打散EXO聚团颗粒，避免影响检测结果。随后，用PBS将EXO样品稀释至合适浓度。

使用NanoSight NS300纳米颗粒跟踪分析仪（英国Malvern PANalytical公司）测定EXO的粒径分布及浓度，配套NTA软件采集数据。首先，使用1 mL无菌注射器抽取稀释后的EXO样品，沿管路缓慢注入以清洗残留杂质；随后注入少量空气排出管路内残留样品，用PBS重复冲洗管路2次。用PBS润洗样品池盖板与激光器接触面，以无尘纸轻拭去除多余液体，避免气泡干扰。安装盖板并通过螺丝对角线固定，确保密封性。

使用1 mL注射器将稀释后的EXO样品注入样品池，通过椭圆形镜片观察确认液面完全覆盖样品池底部（约填充至2/3体积）。将激光器推入仪器指定位置，滑动滑轨至底部，待绿灯亮起后旋转红色开关启动激光。通过软件界面调节屏幕增益和相机增益参数（通常设置为4和11），随后手动调节仪器焦距，确保视野内颗粒清晰不模糊。

在NTA软件的Standard Measurement模块中完成检测参数设置：勾选“Dilution”选项并填写实际稀释倍数；点击“Create Script”生成检测脚本，在“Script panel”中修改“REPEAT”参数（重复检测次数，通常设置为5次）。在“Setting OK”前，调节“Detection Threshold”（检测阈值，通常设置为5）进度条，确保目标颗粒（EXO）在视频中被准确标记为红色“+”信号（避免阈值过高导致小颗粒漏检或阈值过低引发表观颗粒增多）。参数确认后点击“Setting OK”，设备自动开始检测，完成预设重复次数后跳转至“Export Settings”界面，点击“Export”导出原始检测数据及分析报告。

1.5   EXO的透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）检测

取EXO样品于4 ℃、10 000×g离心5 min，吸取10 μL上清液滴加于清洁铜网表面，静置2 min使其自然沉淀；随后用滤纸轻吸去除表面多余液体，立即滴加3%醋酸双氧铀染色液10 μL，继续静置2 min，再次用滤纸吸除浮液，置于空气中常温干燥数分钟。

TEM检测：开启主机及配套控制电脑，依次进入“HV/filament operation”（加速电压/灯丝设定）与“CCD operation”（图像采集）界面，分别完成加速电压（设定为100 kV）与灯丝参数初始化，并启动图像采集系统。依次点击“HV on”（开启高压）与“Filament on”（激活灯丝）按钮，待束流稳定至约10 μA时进行样品观察。

样品上样操作：拔出样品杆，将干燥后的铜网样品固定于样品杆前端，平稳插入电镜样品仓；点击开启电子按钮，通过“Lens Reset”键初始化物镜参数，依次调节亮度、视野范围及放大倍数至目标观察尺度。调整过程中需确保光斑聚焦且居中，待视野亮度均匀后锁定光斑位置；通过高度调节功能确认样品台处于稳定状态（视野无晃动），随后退出高度调节模式。

目标样品观察与拍照：在低倍视野下定位目标区域，逐步放大至5万~10万倍，调整焦距与对比度以清晰显示EXO形态特征，完成拍照记录、上传与图像整理。

1.6   EXO的蛋白浓度检测

将纯化后的B16F10-EXO加入适量的裂解液，并在冰上裂解30 min。裂解后的样品置于－80 ℃冰箱中保存，备用。

根据实验需求，计算出标准品和样品的总孔数。本实验中，标准品设置8个梯度，样品孔数根据实际样品数量确定。每孔加入200 μL工作液，根据总孔数计算出所需工作液的总体积。按照试剂A与试剂B的体积比为50∶1配制工作液，计算所需试剂A和试剂B的体积，将试剂A和试剂B按比例混合，充分混匀后备用。

取8个PCR小管，在1号管中加入120 μL蛋白标准品牛血清白蛋白（5 mg/mL），充分混匀后吸取150 μL加入到2号管，依次类推，直至7号管。8号管不加入标准品，作为对照组。根据稀释倍数计算各管的终浓度，1~8号管分别为2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、0 μg/mL。

取25 μL标准品和合适浓度的目的样品分别添加于96孔板的微孔中。对于预判浓度较低的样品可直接上样25 μL；对于预判浓度较高的样品，可用稀释液稀释后上样25 μL（例如，稀释5倍，即5 μL样品+20 μL稀释液）。各孔加入200 μL BCA工作液，轻轻振荡混匀。于37 ℃孵育30 min后，将96孔板冷却至室温，使用酶标仪测定562 nm处光密度（D）值。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

1.7   EXO标志蛋白的检测

将提取的B16F10-EXO按体积比1∶1加入EXO专用裂解液，充分混匀后冰上裂解10 min；4 ℃、11 000×g离心10 min，吸取上清液作为EXO裂解液。

通过BCA蛋白定量试剂盒测定各样本总蛋白浓度，用对应裂解液将蛋白浓度统一稀释至目标值；向样本中加入1/4体积的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，充分混匀后100 ℃煮样10 min，使蛋白充分变性并形成均一的上样体系。

清洗并晾干玻璃板后，固定于制胶装置中。根据目标蛋白分子量范围选择分离胶浓度。依次配制分离胶与浓缩胶：先向玻璃板间加入7 mL分离胶（6%、8%、10%、12%或15%），覆盖2 mL无水乙醇封胶，室温静置30 min待分离胶完全凝固；弃去乙醇后加入2 mL浓缩胶，插入梳子形成上样孔。

分离胶凝固后拔除梳子，用1×电泳缓冲液清洗上样孔；按等总蛋白量（通常20~50 μg）和等体积原则将样本加入上样孔，缓慢注入避免气泡；接通电源，120 V恒压电泳80 min（根据凝胶浓度及目标条带大小调整时间）。

电泳结束后将凝胶从制胶装置中取出，用1×电转移缓冲液平衡10 min；按“滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸”顺序组装转膜装置，置于转膜槽中，冰浴条件下以300 mA恒流电转80 min，将分离后的蛋白条带转移至PVDF膜上。将PVDF膜浸入封闭液中，室温孵育1 h以阻断非特异性结合位点。

用抗体稀释液按1∶1 000~1∶5 000比例稀释一抗[抗TYRP1抗体（货号ab186929）、抗多巴色素互变异构酶抗体（货号ab221144）、抗谷胱甘肽S-转移酶π1（glutathione S-transferase pi 1，GSTP1）/p28抗体（货号ab129106）、过氧化物还原酶（peroxiredoxin，PRDX）1 /PAG抗体（货号ab5571）]，4 ℃孵育PVDF膜过夜（约16 h），使一抗与目标蛋白特异性结合。PBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min，去除未结合的一抗。

用抗体稀释液按1∶5 000比例稀释HRP标记的二抗[山羊抗兔IgG（货号ab6721）]，室温孵育PVDF膜1 h，形成“抗原-一抗-二抗”复合物。

PBST洗涤4次后，将PVDF膜平铺于保鲜膜上，按1∶1比例混合ECL发光试剂A液与B液，均匀滴加于膜表面；吸去多余试剂后将膜置于暗盒中，暗室曝光，标记预染蛋白标记物位置及样本信息。

1.8   EXO的蛋白质组学成分分析和KEGG通路富集分析

裂解样品经8 mol/L尿素（含蛋白酶抑制剂）涡旋混匀后，冰上超声破碎2 min并裂解30 min，4 ℃、16 000×g离心20 min取上清，BCA定量。

采用iST样本前处理试剂盒（德国PreOmics公司）进行变性（95 ℃、90×g、加热10 min）、还原烷基化、胰蛋白酶消化（37 ℃、45×g、孵育2 h）及肽段除盐（iST cartridge洗脱后真空冻干），冻干肽段重溶于0.1%甲酸水（A相）后，通过串联nanoElute 2系统（美国Bruker Daltonics公司）的timsTOF Pro2质谱仪分析。上样量200 ng，色谱柱采用AUR3-15075 C₁₈分析柱，流速设置为400 nL/min，梯度洗脱程序如下：0~16 min 2.2%~28% B相（80%乙腈+0.1%甲酸），16~24 min 28%~38% B相，24~27 min 38%~90% B相，90% B相维持3 min；柱温50 ℃。

数据非依赖性采集（data-independent acquisition，DIA）数据采用Spectronaut 19软件（瑞士Biognosys公司）分析，参数选用出厂默认设置。以UniProt-Mus musculus数据库（https://www.uniprot.org/proteomes/UP000000589，2025年版本，21701条目，胰蛋白酶酶解）为参考，设置固定修饰为Carbamidomethylation(C, 57.02)、可变修饰为Oxidation(M, 15.9)和Acetyl(protein N-term, 42.01)，通过iRT肽段自动校正保留时间与质量窗口，以前体离子、肽段错误发现率（false discovery rate，FDR）阈值1.0%为定性标准（Decoy数据库通过反转或随机化氨基酸序列生成），经Spectronaut 19软件自动校正与局部归一化处理后，对FDR＜1.0%的肽段采用无标记定量算法（MaxLFQ）进行蛋白群定量。

将差异表达蛋白的基因符号导入DAVID在线平台（https://david.ncifcrf.gov/，6.8版本），物种设定为Mus musculus。基于STRING数据库（https://cn.string-db.org/，12.0版本），对定位于EXO且具有抗氧化功能及黑色素合成功能的蛋白质进行检索，并依据信号强度的高低对互作关系进行排序。利用DAVID的Functional Annotation Tool进行KEGG通路富集分析，以P＜0.05为显著性阈值。显著富集的通路用R 4.3.1绘制气泡图进行可视化。

2   结果

2.1   B16F10细胞的培养和验证

未经处理的B16F10细胞在体外培养条件下呈现典型的恶性细胞形态学特征，显微镜观察显示：该细胞系具有明显的贴壁生长特性；细胞形态以不规则梭形及多角形为主，直径约15~25 μm；细胞边缘可见明显的伪足样突起，提示其可能具有较强迁移能力（图 1A）。经胰酶消化离心后，可在离心管底部观察到特征性的黑色细胞团块（图 1B）。在体内成瘤实验中，于C57BL/6小鼠右侧背部皮下注射含2.5×10⁵个细胞的100 μL PBS悬液。接种后5~7 d可触及皮下结节形成，10 d肉眼可见明显的黑色肿物，12 d解剖观察证实肿瘤组织已成功建立（图 1C、1D）。该细胞系在体内的快速成瘤特性与其体外表现的恶性特征高度一致，证实了B16F10细胞作为黑色素瘤研究模型的可靠性。

图  1  B16F10细胞的培养和验证

Fig.  1  Culture and identification of B16F10 cells

A: Microscopic imaging of B16F10 cells, scale bar＝20 μm; B: Morphology of B16F10 cells from different passages following digestion and centrifugation; C: Observation and dissection of a black subcutaneous tumor on the mouse back at 12 d post-inoculation; D: The resected black tumor tissue.

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2.2   EXO表征分析

本研究从250 mL B16F10细胞上清液中提取EXO，采用EXO沉淀法进行分离纯化，并通过多种技术手段对其物理特性、分子标志及纯度进行了系统鉴定，最终获得400 μL B16F10-EXO（图 2A）。TEM观察结果（图 2B）显示，B16F10-EXO呈现出典型的双层膜结构和杯盘状形态，表面被膜双层包被，呈圆形，符合EXO的经典超微结构特征。NTA（图 2C）显示，所提取的EXO浓度为1.76×10¹¹颗粒/mL，B16F10-EXO的粒径分布呈单峰形态，众数粒径约为114.3 nm，符合EXO公认的尺寸范围（30~150 nm），表明提取的EXO在物理特性上具有高度均一性，满足后续功能研究的形态学要求。蛋白质印迹法检测结果表明，与B16F10细胞上清对照，提取的B16F10-EXO中可检测到CD63、CD81、TSG101等EXO标志蛋白的特异性条带（图 2D）。综合形态观察、粒径分析及标志蛋白鉴定结果证实，本研究提取的B16F10-EXO形态完整、纯度较高，有效去除了细胞碎片、微囊泡等杂质，分离纯化方法稳定可靠，可为后续生物学功能研究提供合格实验材料。

图  2  B16F10细胞EXO的提取和表征分析

Fig.  2  Isolation and characterization of EXO derived from B16F10 cells

A: Schematic diagram of B16F10 exosome isolation using chemical precipitation; B: Representative transmission electron microscopy image of exosomes, showing the typical cup-shaped morphology with bilayer membrane structure; C: Nanoparticle tracking analysis profiling: size distribution and average concentration; D: Western blotting analysis of exosomal marker proteins (CD63, TSG101, CD9, and CD81). EXO: Exosome; a.u.: Arbitrary unit.

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2.3   B16F10-EXO蛋白的分子量分布与KEGG通路分析

结果显示，B16F10-EXO中共鉴定出2 249种蛋白质。对这些蛋白的分子量进行统计分析，其平均分子量为73 600±67 600，中位数为54 000，B16F10-EXO蛋白的分子量分布呈现出一定的离散性（图 3A），反映了其在细胞间通信和生物学功能中的复杂性和多样性。

图  3  B16F10细胞来源外泌体蛋白的分子量分布与KEGG通路分析

Fig.  3  Proteomic profiling and KEGG pathway analysis of B16F10-derived exosomes

A: Molecular weight distribution of exosomal proteins; B: KEGG pathway enrichment analysis of the exosomal proteome. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.

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基于DAVID数据库，对鉴定到的B16F10-EXO蛋白进行KEGG通路富集分析，筛选出P＜0.05且富集分数排名前20的通路。分析结果（图 3B）显示，这些蛋白质主要参与了细胞内的代谢通路，具体包括胰岛素信号通路（mmu04910）、细胞凋亡（mmu04210）、mTOR信号通路（mmu04150）以及化学致癌-活性氧（mmu05208）等通路。这些通路在特定实验条件下显著富集，提示它们可能在黑色素瘤细胞的生理活动以及与周围细胞的相互作用中发挥着关键作用。

2.4   抗氧化蛋白和黑色素合成相关蛋白筛选与鉴定

2.4.1   抗氧化蛋白筛选分析

根据蛋白质的主要功能筛选出具有抗氧化应激功能的蛋白共计49种。相对表达量居前20的抗氧化蛋白中，表达量较高的是PRDX1、含硫氧还蛋白结构域蛋白12（thioredoxin domain-containing protein 12，TXNDC12）、PRDX2、铁蛋白轻链1（ferritin light chain 1，FTL1）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）、GSTP1和谷胱甘肽S-转移酶ω 1（glutathione S-transferase ω 1，GSTO1）等。这些蛋白在细胞抗氧化防御机制中具有重要作用，能够清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）等有害物质，维持细胞内氧化还原平衡。见图 4A。

图  4  B16F10细胞来源外泌体抗氧化及黑色素合成相关蛋白的表达谱、相互作用网络与验证

Fig.  4  Expression profiling, interaction network, and validation of antioxidant and melanogenesis-related proteins in B16F10-derived exosomes

A: Heatmap showing the expression levels of the top 20 antioxidant proteins; B: Protein-protein interaction networks highlighting the top 10 antioxidant proteins; C: Heatmap showing the expression levels of the top 5 melanogenesis-related proteins; D: Protein-protein interaction networks highlighting the top 5 melanogenesis-related proteins; E: Western blotting analysis confirming the presence of selected antioxidant and melanogenesis-related proteins.

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将相对表达量前10位的抗氧化应激相关蛋白输入STRING网站进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。结果显示，PRDX1、PRDX2、GSTO1和GSTP1是EXO蛋白质网络中的枢纽蛋白，它们与其他蛋白存在广泛的相互作用关系（图 4B）。

2.4.2   黑色素合成相关蛋白筛选与分析

结果（图 4C）显示，相对表达量较高的蛋白包括TYRP1、TYRP2、黑色素瘤T细胞识别抗原1（melanoma antigen recognized by T-cells 1，MLANA）、前黑色素小体蛋白（premelanosome protein，PMEL）和TYR。本研究并未检测到文献报道过的小眼相关转录因子^[21]（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）。上述这些蛋白在黑色素合成过程中发挥关键作用，为研究B16F10-EXO在黑色素合成调控中的潜在机制提供了基础，也为其可能补充因氧化应激受损的黑色素细胞的黑色素合成相关蛋白提供了支撑。

将相对表达量较高的黑色素合成相关蛋白输入STRING网站进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。结果（图 4D）显示，TYRP1和TYRP2是B16F10-EXO蛋白质网络中的枢纽蛋白，它们与其他蛋白存在相互作用关系。这一结果表明，TYRP1和TYRP2在细胞内可能发挥着重要的调控作用，通过与其他蛋白的相互作用，参与黑色素合成的调控过程。

蛋白质印迹法检测（图 4E）证实了在B16F10-EXO中存在组学检测结果中部分抗氧化（PRDX1，GSTO1）及黑色素生成相关蛋白（TYRP1，TYRP2）的表达。

3   讨论

3.1   B16F10-EXO富含关键抗氧化蛋白提示其强大的氧化损伤缓解潜能

本研究通过蛋白质组学分析从B16F10-EXO中成功鉴定出49种具有抗氧化应激功能的蛋白质。其中表达量最高的组分包含了PRDX1、PRDX2、TXNDC12、GSTP1等核心抗氧化分子。这一发现直接证明了EXO本身即是一个高度浓缩的抗氧化蛋白“武器库”，为其应用于氧化应激相关疾病治疗提供了坚实的物质基础。

首先，高表达的过氧化物还原酶家族是细胞内最重要的过氧化氢清除剂之一^[22]。它们能高效还原过氧化氢、过氧亚硝基等过氧化物，从而保护细胞免受氧化损伤^[22-23]。在本研究鉴定的B16F10-EXO中，PRDX1和PRDX2的高丰度存在暗示其被递送到受体细胞后能直接增强细胞清除过氧化物的能力，为细胞提供第一道防线。

其次，硫氧还蛋白系统（如TXNDC12）和谷胱甘肽系统（如GSTP1）是维持细胞内氧化还原平衡的两大核心系统^[24]。TXNDC12作为硫氧还蛋白超家族成员，参与调节蛋白质二硫键的还原状态，对维持酶活性和抵抗内质网应激至关重要^[25]。而GSTP1则通过催化亲电子毒物与谷胱甘肽的结合，完成Ⅱ相解毒反应，特别是在清除脂质过氧化终产物中发挥关键作用^{[24, 26]}。这些蛋白的富集表明B16F10-EXO不仅能够直接清除ROS，还具备调节细胞整体抗氧化通路的潜能。

此外，FTL1的高表达也具有重要意义。FTL1通过结合游离铁离子有效防止芬顿反应的发生^[27]，从而从源头上抑制羟基自由基等最具破坏性ROS的生成^[28]。而PEDF作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，已被证实具有强大的神经营养和抗氧化活性，能够通过上调谷胱甘肽合成相关酶的表达增强细胞的抗氧化能力。这些蛋白的协同存在构成了一个从预防（铁离子管理）到清除（过氧化物还原）再到修复（解毒与信号调节）的多层次、综合性抗氧化网络^{[24, 29]}。

综上所述，本研究最重要的发现在于证实B16F10-EXO中天然包裹并富集了一套高效且完整的抗氧化蛋白系统。这一特性使其不同于单纯的抗氧化剂，而是作为一个复杂的信号“工具箱”被递送到靶细胞^[30]。这为解释B16F10-EXO在白癜风等氧化应激失衡疾病模型中的潜在治疗作用提供了强有力的机制假说，即通过直接补充关键抗氧化酶，重塑病变部位的氧化还原平衡，从而为细胞的存活和功能恢复创造有利的微环境^[31]。

3.2   B16F10-EXO促进黑色素合成潜能

本研究成功从B16F10-EXO中鉴定出包括TYRP1、TYRP2、MLANA-A、PMEL和TYR在内的完整黑色素合成关键蛋白组^[17]。这些蛋白的高表达提示其可能作为一种功能性的“蛋白质补偿包”直接参与靶细胞黑色素合成代谢的调控。

值得注意的是，蛋白质-蛋白质相互作用网络分析显示TYRP1与TYRP2处于网络枢纽位置。TYRP1与TYR共同构成黑色素合成的核心酶复合体，前者不仅能稳定TYR蛋白结构，其本身也具有多巴色素互变异构酶活性，确保黑色素合成的正确方向。而TYRP2则在黑色素合成途径中催化一个关键步骤^[17]。这2个枢纽蛋白的存在表明B16F10-EXO所携带的并非孤立的催化元件，而是一个具有功能协同性的酶系统。当B16F10-EXO被处于氧化应激下的受损黑色素细胞或前体细胞摄取后，这些蛋白可能直接补充或增强细胞内业已削弱的黑色素合成机器，从而绕过因应激而功能受损的内源性合成通路，快速启动色素生成。

多项研究已证实MITF在B16F10细胞核内高表达^{[30, 32-33]}，但本研究未在B16F10-EXO中检测到MITF。此现象可通过EXO的生物发生机制及MITF的自身特性得到合理解释。

首先，MITF的亚细胞定位决定了其难以进入EXO。MITF是一个转录因子，其主要功能行使场所位于细胞核。而EXO的形成起源于细胞内吞过程中产生的内体膜系统，其中包括蛋白质、核酸的分选是一个高度选择性且主动包裹的过程^{[30, 32]}。目前公认的是，EXO的分选机制倾向于将胞质蛋白、膜蛋白以及某些特定的核蛋白招募到多泡体内进而分泌至胞外。像MITF这类缺乏特定分选信号且定位于核内的蛋白质被动进入EXO的概率极低。多项蛋白质组学研究均证实，EXO中核蛋白尤其是核心转录因子的丰度远低于其亲本细胞^[34]。

其次，有证据表明细胞存在主动阻止某些关键调控因子进入EXO的机制，以维持细胞的稳态^{[33, 35]}。类比推测，MITF作为调控细胞增殖、分化和存活的主调控蛋白，其细胞内浓度和功能受到精密调控。细胞可能通过类似的机制避免将如此关键的调控因子“泄露”到EXO中，从而维持自身基因表达程序的稳定性^{[33, 35]}。

此外，一个更具功能意义的假说认为，EXO可能选择性地包装其下游效应分子，而非顶层的调控指令。本研究发现，B16F10-EXO中富含TYR、TYRP1、TYRP2等黑色素合成的关键功能酶，而这些酶正是由MITF转录激活的产物。这表明，B16F10-EXO传递的是一套“执行工具”（功能蛋白），而非“生产图纸”（转录因子）。这种策略可能更高效，受体细胞无需启动复杂的基因转录和翻译过程，即可直接获得执行黑色素合成的功能单元，这对于快速应对外部信号或压力（如氧化应激）具有重要生理意义^{[17, 36]}。

综合蛋白质组与蛋白质-蛋白质相互作用网络分析结果，本研究提出如下假说：B16F10-EXO通过富集并递送以TYRP1/TYRP2为核心的黑色素合成关键功能蛋白，直接补充了黑色素合成通路中的核心酶活性。这种作用模式尤其适用于白癜风等以氧化应激导致黑色素细胞功能衰竭或死亡为特征的病理状态^[36]。对于功能受损的黑色素细胞，EXO可提供直接的酶活性支援；对于黑色素前体细胞，则可能提供分化和功能启动所必需的蛋白组件^[17]。

3.3   B16F10-EXO通过协同抗氧化与补充黑色素合成酶双重机制缓解白癜风病理过程的潜力

本研究的蛋白质组学分析揭示，B16F10-EXO同时富含强大的抗氧化蛋白网络和完整的黑色素合成关键酶系统，这一独特的分子构成为将其应用于白癜风治疗提供了极具吸引力的机制基础。白癜风的核心病理在于氧化应激驱动下针对黑色素细胞的自身免疫攻击，最终导致局部黑色素细胞缺失和色素合成障碍。本研究结果表明，B16F10-EXO可能通过一种多靶点、协同性的方式干预这一病理过程。

3.3.1   针对氧化应激微环境的重塑：为黑色素细胞存活创造前提

白癜风皮损区一个标志性特征是氧化还原平衡的破坏，过量的ROS不仅是直接损伤黑色素细胞的内在诱因，还能通过诱导新抗原暴露等方式触发免疫反应。本研究发现EXO携带了包括PRDX1、PRDX2、TXNDC12、GSTP1、FTL1等在内的多层次抗氧化蛋白。当EXO被靶细胞（包括受损的黑色素细胞、角质形成细胞甚至免疫细胞）摄取后，这些蛋白可迅速增强细胞清除过氧化物和解毒醛类脂质过氧化产物的能力。这种高效的抗氧化支持有望直接中和白癜风皮损区的氧化应激压力，减轻其对黑色素细胞的直接毒性^[35]，并可能通过降低免疫原性来间接抑制异常的自身免疫应答，为黑色素细胞的存活和功能恢复创造一个“保护性微环境”。

3.3.2   针对黑色素合成机器的直接补充：实现功能的快速重启

在氧化应激等因素作用下，黑色素细胞的功能往往严重受损，其内源性黑色素合成酶（如TYR、TYRP1、TYRP2）的活性和稳定性下降。本研究发现B16F10-EXO中含有高丰度的黑色素合成关键功能酶，且TYRP1/TYRP2构成蛋白质-蛋白质相互作用网络的枢纽。尤为重要的是，B16F10-EXO中检测到的是执行终末功能的效应分子，而非其上游调控因子（如MITF）。这种“工具包”式的递送策略具有显著优势，它绕过了因应激而可能受阻的细胞内信号转导和基因转录过程，直接为功能衰竭的黑色素细胞“补给”现成的催化机器^[30]。这意味着，即使细胞自身的生物合成能力暂时低下，也能通过B16F10-EXO的补充快速重启黑色素合成通路，从而实现比传统仅刺激内源性表达的策略更迅速、更直接的疗效。

3.3.3   双重机制的协同与意义：一个“既治标又治本”的治疗假说

本研究认为，B16F10-EXO的治疗潜力正源于上述双重机制的协同作用。抗氧化机制致力于解决白癜风的“病因”，即清除氧化应激这一始动因素，为组织修复提供基础；而补充黑色素合成酶机制则直接针对白癜风的“结果”，即弥补色素合成功能的缺失。两者相辅相成，一个稳定、低氧化应激的微环境有利于B16F10-EXO递送的酶发挥最佳活性，并保护新生成的黑色素；而功能恢复的黑色素细胞本身也有助于维持局部的氧化还原稳态。这种“既治标又治本”的特性使B16F10-EXO疗法特别适用于治疗那些黑色素细胞尚未完全凋亡、但功能处于“瘫痪”状态的稳定期或难治性白癜风患者。

本研究提出的“双重协同机制”假说，其优势在于超越了单一疗法的局限性。既往尝试通过补充单一抗氧化剂（如N-乙酰半胱氨酸）或刺激内源性黑色素合成，往往因无法在复杂的病理微环境中形成有效保护网络或绕过功能受损的细胞合成机器而疗效不彰^[37]。例如，外源性补充的单一抗氧化酶易失活且难以靶向递送^[38]；而仅刺激MITF表达，在氧化应激未解除的微环境中其下游效应蛋白的翻译后修饰与稳定性仍可能受损^[39]。B16F10-EXO的独特价值在于其“天然负载功能网络”的特性，它不仅同时提供了从预防（如FTL1控铁）、清除（如PRDX1、PRDX2、GSTP1）到修复，如硫氧还蛋白系统的多层次抗氧化防御，更关键的是它直接将执行终末功能的黑色素合成酶系统（TYR、TYRP1、TYRP2）递送至靶细胞。这种既改善微环境又提供功能酶的策略有望实现抗氧化保护与功能重建在时空上的精准协同——稳定的氧化还原微环境保障了递送酶的最佳活性，而快速重启的色素合成本身也有助于细胞稳态的恢复。

3.4   本研究的局限与未来展望

B16F10细胞作为肿瘤细胞系，B16F10-EXO是否携带致瘤性或促瘤风险是临床转化必须正视的核心安全问题。尽管有研究表明，通过严格纯化流程获得的B16F10-EXO其内容物（如致癌性核酸）的载量与活性可能显著降低^[40]，且本蛋白质组学数据未检测到典型的强致癌蛋白，但这远不足以证明其绝对安全。前期评估必须包括：通过体外实验验证B16F10-EXO是否促进正常细胞（如人角质形成细胞）的恶性转化或异常增殖；在免疫健全动物模型中长期观察其局部和系统应用是否诱发肿瘤或促进现有肿瘤生长。一种可行的去风险化策略是对提取的EXO进行进一步处理，如γ射线照射或利用亲和色谱去除特定潜在风险分子^[41]，或将B16F10-EXO中鉴定出的关键有益蛋白“鸡尾酒”装载到更安全的载体（如间充质干细胞来源的EXO）中，构建“仿生”治疗制剂^[42-43]。只有在充分的安全性评估基础上才能审慎推进其临床应用探索。

综上所述，本研究从分子水平证实了B16F10-EXO具备通过重塑氧化还原微环境和直接补充功能酶来干预白癜风病理的双重潜能，这为开发一种针对白癜风病因的新型无细胞治疗策略提供了强有力的理论依据和候选分子库^[32]。未来的研究将着重于在白癜风细胞和动物模型中验证这一假说，并进一步探索这些EXO蛋白被受体细胞摄取后的活性及其对整体细胞功能的最终影响。