2. 甘肃省计划生育科学技术服务中心,兰州 730000
2. Family Planning Science and Technology Service Center of Gansu Province, Lanzhou 730000, Gansu, China
癌症是严重威胁人类健康的疾病,目前已成为世界上仅次于心血管疾病的第二大因病致死原因,其中肺癌是最常见的癌症类型和最主要的癌症死亡原因(占总病例的11.6%,占总癌症死亡病例的18.4%)[1]。化疗是肺癌的传统治疗手段,在肺癌的综合治疗和辅助治疗中占有重要地位,但仍然存在不良反应发生率较高和耐药等问题[2]。研发药效显著、安全性高、成本较低的肺癌治疗药物至关重要。去氧地胆草素(deoxyelephantopin,Deo)是菊科植物地胆草(Elephantopus scaber L.)中重要的倍半萜类化合物,具有显著的抗癌活性,在肿瘤化疗方面存在潜在的价值[3]。本研究考察了Deo诱导人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的体外作用机制,明确了Deo通过活性氧(reactive oxygen species,ROS)调控线粒体介导的凋亡途径促进A549细胞凋亡,报告如下。
1 材料和方法 1.1 细胞和试剂A549细胞(目录号:SCSP-503)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;BALB/c裸小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物生产许可证号:SCXK(京)2021-0006];Deo(CAS号:29307-03-7)购于四川恒诚致远生物科技有限公司;DMEM培养基、FBS和胰蛋白酶购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;DMSO、Hoechst 33342和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)购于美国Sigma公司;CCK-8、2’, 7’-二氯荧光素二乙酸酯(2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)、青霉素-链霉素双抗、TUNEL检测试剂盒(绿色荧光)和ECL Plus超敏化学发光液购于北京索莱宝科技有限公司;牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)和Na3VO4购于上海泰坦科技股份有限公司;所用抗体均购于美国Signalway Antibody公司。
1.2 细胞活力检测将A549细胞接种于96孔板,每孔100 µL,细胞密度为1×104个/mL,待细胞贴壁后依次加入终浓度为1、2、4、8、16和32 μmol/L的Deo,空白组使用载体溶液(0.1% DMSO)作为对照,每组平行8孔。在Deo作用12、24和48 h后分别向每孔加入10 µL CCK-8溶液,继续培养2 h后测定450 nm处的光密度值,计算细胞存活率和Deo对A549细胞的IC50。
1.3 细胞产生ROS检测将A549细胞接种于12孔板,每孔约2×105个细胞,待细胞生长至完全贴壁且部分融合后,更换含Deo(10 μmol/L)或10 μmol/L Deo+5 mmol/L NAC(ROS清除剂)的培养基培养细胞24 h,弃去含药的培养基;以无血清培养基为溶剂配制浓度为10 μmol/L的DCFH-DA溶液,每孔加入500 μL,在培养箱中孵育30 min后观察、拍照。
1.4 细胞凋亡检测(1) 将A549细胞接种于12孔板,每孔约2×105个细胞,待细胞贴壁生长后,分别采用10 μmol/L Deo和10 μmol/L Deo+5 mmol/L NAC处理24 h,弃去含药培养基,加入10 μL浓度为5 mg/L的Hoechst 33342染液,在培养箱中孵育15 min后观察、拍照。(2)将A549细胞接种于6孔板,每孔约4×105个细胞,分别采用10 μmol/L Deo和10 μmol/L Deo+5 mmol/L NAC处理24 h,用胰蛋白酶消化细胞,1 000×g离心10 min后收集细胞,加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染液,在培养箱中孵育20 min后,用流式细胞术对细胞进行检测。
1.5 线粒体膜电位检测将A549细胞接种于6孔板,每孔约4×105个细胞,用5、10和20 μmol/L Deo处理细胞24 h和48 h,用胰蛋白酶消化细胞,向收集的细胞中加入无酶的罗丹明123试剂,在培养箱中孵育30 min后,上流式细胞仪进行检测。
1.6 凋亡相关蛋白的检测A549细胞培养至完全贴壁后,用5、10和20 μmol/L Deo分别处理48 h,弃培养液后用预冷PBS清洗2次,分别进行qPCR和蛋白质印迹法检测。qPCR引物序列:Bax正、反向引物序列分别为5'-CCTGCTG-ATCTATCAGCACAGAT-3'、5'-AGTGACTCAGA-TGCCGAAGTG-3',caspase-3正、反向引物序列分别为5'-ATGGAGAACACTGAAAACTCAGT-3'、5'-CGTCAAAGGAAAAGGACTCAAAT-3',Bcl-2正、反向引物序列分别为5'-AGGGTACGATAACC-GGGAG-3'、5'-TCACTTGTGGCCCAGATAGG-3',GAPDH正、反向引物序列分别为5'-AGAAGGCT-GGGGCTCATTTG-3'、5'-AGGGGCCATCC ACAGT-CTTC-3'。目的基因的mRNA相对表达量使用2-ΔΔCt法计算。
1.7 体内实验验证Deo对移植瘤的影响将4周龄BALB/c裸小鼠分为对照组、10 mg·kg-1·d-1 Deo组、20 mg·kg-1·d-1 Deo组,每组6只。各组裸小鼠饲养7 d后,皮下注射约1×107个A549细胞,当肿瘤体积>50 mm3时,10 mg·kg-1·d-1 Deo组、20 mg·kg-1·d-1 Deo组每天腹腔注射相应剂量的Deo,对照组每天腹腔注射同等体积的生理盐水。每隔2 d测量移植瘤的长和宽,通过公式计算肿瘤体积(肿瘤体积=长度×宽度2×0.5)。给药17 d后腹腔注射异戊巴比妥钠200 mg/kg处死裸小鼠,小心剥离实体瘤组织,精确称重,随后用PBS清洗2次,置于10%甲醛溶液中固定,石蜡包埋、切片,进行H-E和TUNEL染色。H-E染色切片在显微镜下观察、拍照,通过Image-Pro Plus 6.0软件分析肿瘤组织中的坏死面积。TUNEL染色切片在荧光显微镜下观察、拍照,通过Image-Pro Plus 6.0软件分析肿瘤组织中的TUNEL阳性细胞数量和DAPI标记的总细胞数量,计算细胞凋亡指数。
1.8 统计学处理采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以 x±s表示,组间比较采用单因素方差分析和Tukey多重比较。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 Deo对A549细胞活力的影响如图 1所示,在Deo作用时间相同的情况下,A549细胞活力随着Deo浓度的增加而下降,Deo作用A549细胞12、24和48 h的IC50分别为17.64、10.56和3.88 μmol/L;在Deo作用浓度相同的情况下,可以明显观察到A549细胞活力随着Deo的作用时间延长而下降。
![]() |
图 1 CCK-8法检测Deo对A549细胞活力的影响 n=8, x±s. CCK-8:细胞计数试剂盒8;Deo:去氧地胆草素. |
2.2 Deo对A549细胞中ROS累积的影响
DCFH-DA染色结果(图 2)显示,10 μmol/L Deo处理24 h后A549细胞内ROS含量比对照组高(P<0.01),且Deo组的细胞表现出形态扁圆、皱缩、状态欠佳;而与10 μmol/L Deo组比较,10 μmol/L Deo+5 mmol/L NAC组细胞内ROS含量减少(P<0.01),并且细胞形态没有明显的变化。
![]() |
图 2 DCFH-DA染色法分析Deo对A549细胞内ROS含量的影响 A:荧光显微镜获得的明场(上)和荧光(下)图像(400×);B:各组荧光强度的比较. **P<0.01与对照组比较;△△P<0.01与Deo (10 μmol/L)组比较. n=3,x±s. DCFH-DA:2’, 7’-二氯荧光素二乙酸酯;Deo:去氧地胆草素;ROS:活性氧;NAC:N-乙酰半胱氨酸. |
2.3 Deo对A549细胞凋亡的影响
Hoechst 33342染色结果(图 3A)显示,10 μmol/L Deo组A549细胞核固缩裂解,产生凋亡小体,细胞发生皱缩、形态变得扁圆,并且细胞未发生汇合;10 μmol/L Deo+5 mmol/L NAC组细胞的核固缩和凋亡小体比Deo组明显减少,细胞核形态规则、核膜完整,细胞形态无明显变化。流式细胞术检测结果(图 3B)显示,10 μmol/L Deo组凋亡细胞较对照组明显增多,而10 μmol/L Deo+5 mmol/L NAC组凋亡细胞较10 μmol/L Deo组明显减少(均P<0.01)。
![]() |
图 3 Hoechst 33342染色和流式细胞术分析Deo对A549细胞凋亡的影响 A:Hoechst 33342染色,荧光显微镜获得的明场(上)和荧光(下)图像(400×,箭头所示为细胞内凋亡小体);B:流式细胞术获得的A549细胞凋亡数据. **P<0.01与对照组比较;△△P<0.01与Deo (10 μmol/L)组比较. n=3,x±s. Deo:去氧地胆草素;NAC:N-乙酰半胱氨酸. |
2.4 Deo对A549细胞线粒体膜电位的影响
流式细胞术分析结果(图 4)显示,A549细胞中线粒体膜电位随着Deo浓度的升高和培养时间的延长呈现出下降趋势。
![]() |
图 4 流式细胞术分析Deo对A549细胞线粒体膜电位的影响(罗丹明123染色) **P<0.01与相同时间点的对照组比较;△△P<0.01与相同浓度Deo组处理24 h时比较. n=3,x±s. Deo:去氧地胆草素. |
2.5 Deo对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响
qPCR检测结果(图 5A)显示,5、10、20 μmol/L Deo组A549细胞中Bax和caspase-3 mRNA表达高于对照组(均P<0.05),且随着Deo浓度的增高而升高;10、20 μmol/L Deo组Bcl-2 mRNA表达低于对照组(均P<0.01),且随着Deo浓度的增高而降低。蛋白质印迹法检测结果(图 5B)显示,Bax、活化caspase-3(cleaved caspase-3)和细胞质中细胞色素C的表达随着Deo浓度的增高而升高,而Bcl-2的表达随着Deo浓度的增高而降低。
![]() |
图 5 qPCR和蛋白质印迹法检测Deo对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响 A:qPCR;B:蛋白质印迹法. **P<0.01与对照组比较. n=3,x±s. qPCR:定量聚合酶链反应;Deo:去氧地胆草素;Bax:Bcl-2相关X蛋白;Bcl-2:B淋巴细胞瘤基因;caspase-3:胱天蛋白酶3;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶. |
2.6 Deo对A549细胞异体移植瘤的影响
如图 6所示,10 mg·kg-1·d-1 Deo组、20 mg·kg-1·d-1 Deo组裸小鼠A549细胞移植瘤生长较对照组缓慢,给药17 d后移植瘤体积明显小于对照组(均P<0.05)。Deo给药17 d后,10 mg·kg-1·d-1 Deo组、20 mg·kg-1·d-1 Deo组裸小鼠移植瘤重量分别为(710±83)、(423±51)mg,均低于对照组[(982±105)mg](均P<0.01)。通过H-E染色和TUNEL染色分析裸小鼠A549细胞移植瘤组织中坏死面积和凋亡指数,结果(图 7)显示,10 mg·kg-1·d-1 Deo组、20 mg·kg-1·d-1 Deo组肿瘤组织坏死面积和凋亡指数高于对照组(均P<0.01)。
![]() |
图 6 Deo对裸小鼠A549细胞移植瘤生长的影响 A:给药17 d后裸小鼠外观;B:移植瘤体积变化. *P<0.05,**P<0.01与相同时间点的对照组比较. n=6,x±s. Deo:去氧地胆草素. |
![]() |
图 7 H-E染色和TUNEL检测分析Deo对裸小鼠A549细胞移植瘤组织坏死和细胞凋亡的影响 A:H-E染色图(200×);B:肿瘤坏死面积定量分析;C:TUNEL检测图(200×);D:细胞凋亡指数分析. **P<0.01与对照组比较. n=6,x±s. H-E:苏木精-伊红;TUNEL:原位末端转移酶标记技术;Deo:去氧地胆草素. |
3 讨论
有研究表明Deo能抑制肿瘤细胞增殖和迁移、增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性、诱导肿瘤细胞凋亡等,并且可以通过诱导氧化应激、抑制NF-κB表达和导致线粒体功能障碍促进肿瘤细胞凋亡[4-5],但Deo对肺癌细胞的具体调控机制尚不清楚。本研究证实Deo可通过诱导细胞内ROS含量增加,激活线粒体凋亡通路,促进A549细胞凋亡的发生;动物实验发现,10 mg·kg-1·d-1和20 mg·kg-1·d-1 Deo给药17 d后对裸小鼠A549细胞移植瘤的体积和重量均有明显的抑制效果,并且对肿瘤组织坏死和细胞凋亡均有明显的促进作用。
ROS是细胞内正常的代谢产物,是一类短寿命、高活性的含氧分子,细胞中一系列氧化还原反应可维持其动态平衡[6-7]。ROS可引起DNA损伤,过量的ROS会对蛋白质、核酸、脂质、膜和细胞器造成损害,诱发氧化应激反应,激活细胞凋亡信号通路[8-10]。ROS与肿瘤的发生、发展、凋亡密切相关,肿瘤细胞中ROS的产生增加、氧化还原状态发生改变,靶向线粒体增加ROS的含量是抗肿瘤的有效途径之一[11-12]。本研究通过DCFH-DA染色检测细胞内ROS含量发现,Deo干预后A549细胞中ROS含量提高,而加入ROS清除剂NAC后细胞中的ROS的含量减少,表明Deo促进A549细胞凋亡与细胞内ROS含量的变化密切相关。
细胞受到药物刺激会产生大量的ROS,若这些ROS未被及时清除就会损伤细胞线粒体膜,导致Bax/Bcl-2比值升高,打开线粒体膜通道孔,使线粒体膜的通透性增高[6, 13]。此外,ROS会使细胞色素C与双磷脂酰甘油分离,通过线粒体膜外流到细胞质中,激活与细胞凋亡有关的caspase家族蛋白的表达。caspase-3在细胞凋亡的执行阶段发挥重要作用,上游的凋亡信号切割caspase-3使其变成具备酶活性的cleaved caspase-3,并执行最后的凋亡程序[6, 14-15]。本研究采用流式细胞术检测A549细胞中线粒体膜电位的变化,发现随着Deo浓度的升高线粒体膜电位呈现出下降的趋势,结合qPCR和蛋白质印迹法对凋亡相关蛋白表达的检测结果,表明Deo促进A549细胞的凋亡是通过激活线粒体凋亡途径来实现的。
综上所述,本研究通过体内外实验探讨了Deo抑制肺癌A549细胞的作用机制,明确了Deo通过诱导ROS调控线粒体介导的细胞凋亡途径促进了A549细胞的凋亡,为Deo的临床药物开发及应用奠定了良好的基础。后续我们将继续探索Deo诱导A549细胞凋亡的关键作用靶点,深入了解Deo的活性和功能,为肺癌的靶向治疗提供新的思路。
[1] |
SUNG H, FERLAY J, SIEGEL R L, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2021, 71(3): 209-249. DOI:10.3322/caac.21660 |
[2] |
中华医学会肿瘤学分会, 中华医学会杂志社. 中华医学会肺癌临床诊疗指南(2023版)[J]. 中华医学杂志, 2023, 103(27): 2037-2074. DOI:10.3760/cma.j.cn112137-20230510-00767 |
[3] |
LAGOUTTE R, SERBA C, WINSSINGER N. Synthesis of deoxyelephantopin analogues[J]. J Antibiot, 2018, 71(2): 248-256. DOI:10.1038/ja.2017.132 |
[4] |
KABEER F A, RAJALEKSHMI D S, NAIR M S, et al. Molecular mechanisms of anticancer activity of deoxyelephantopin in cancer cells[J]. Integr Med Res, 2017, 6(2): 190-206. DOI:10.1016/j.imr.2017.03.004 |
[5] |
MEHMOOD T, MUANPRASAT C. Deoxyelephantopin and its isomer isodeoxyelephantopin: anti-cancer natural products with multiple modes of action[J]. Molecules, 2022, 27(7): 2086. DOI:10.3390/molecules27072086 |
[6] |
周建敏, 刘鑫玉, 刘远莉, 等. ROS在肿瘤细胞中的调控作用及相关的抗肿瘤策略[J]. 生命的化学, 2022, 42(12): 2214-2221. DOI:10.13488/j.smhx.20220686 |
[7] |
SRINIVAS U S, TAN B W Q, VELLAYAPPAN B A, et al. ROS and the DNA damage response in cancer[J]. Redox Biol, 2019, 25: 101084. DOI:10.1016/j.redox.2018.101084 |
[8] |
REDZA-DUTORDOIR M, AVERILL-BATES D A. Activation of apoptosis signalling pathways by reactive oxygen species[J]. Biochim Biophys Acta, 2016, 1863(12): 2977-2992. DOI:10.1016/j.bbamcr.2016.09.012 |
[9] |
孟路华, 冯蕾, 刘振. 天然产物通过增加活性氧抗肿瘤的研究进展[J]. 中国药房, 2019, 30(8): 1148-1152. DOI:10.6039/j.issn.1001-0408.2019.08.26 |
[10] |
MOLONEY J N, COTTER T G. ROS signalling in the biology of cancer[J]. Semin Cell Dev Biol, 2018, 80: 50-64. DOI:10.1016/j.semcdb.2017.05.023 |
[11] |
TRACHOOTHAM D, ALEXANDRE J, HUANG P. Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms: a radical therapeutic approach?[J]. Nat Rev Drug Discov, 2009, 8(7): 579-591. DOI:10.1038/nrd2803 |
[12] |
郑坤, 嘎鲁, 马宇衡, 等. 活性氧(ROS)依赖性抗肿瘤药物的研究进展[J]. 广东药科大学学报, 2022, 38(1): 130-136. DOI:10.16809/j.cnki.2096-3653.2021092801 |
[13] |
WANG X, WEI L, LI Q, et al. HIF-1α protects osteoblasts from ROS-induced apoptosis[J]. Free Radic Res, 2022, 56(2): 143-153. DOI:10.1080/10715762.2022.2037581 |
[14] |
CUI L, BU W, SONG J, et al. Apoptosis induction by alantolactone in breast cancer MDA-MB-231 cells through reactive oxygen species-mediated mitochondrion-dependent pathway[J]. Arch Pharm Res, 2018, 41(3): 299-313. DOI:10.1007/s12272-017-0990-2 |
[15] |
WONG R S Y. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2011, 30(1): 87. DOI:10.1186/1756-9966-30-87 |