2. 海军军医大学(第二军医大学)海军医学系海军营养与食品卫生学教研室, 上海 200433
2. Department of Naval Nutrition and Food Hygiene, Faculty of Naval Medicine, Naval Medical University (Second Military Medical University), Shanghai 200433, China
应激又称为压力,是当身体应对超出自身所能承受的刺激时所表现出的一种系统性的、非特异性的反应[1]。伴随着社会生活和工作节奏的加快,当代人各个层面的压力正在不断增加,越来越多的人出现各种躯体和精神方面的异常症状。关于应激对食欲的影响已有大量研究,然而应激源停止(或脱离应激环境)后食欲的变化及机制的相关研究甚少。下丘脑是机体神经中枢影响摄食行为的核心,也是应激影响的主要脑区,其中紧邻第三脑室的弓状核是下丘脑中影响食欲的一个重要核团,包含多个与食欲调控有关的影响因子[2]。在众多动物应激模型中,慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)与人类心身疾病具有高度相似性,因此本研究采用此模型,通过观察C57BL/6小鼠体重和摄食量变化,检测下丘脑食欲调节因子食欲素1型受体(orexin 1 receptor,OX1R)、瘦素受体(leptin receptor,LEPR)和刺鼠相关蛋白(agouti-related protein,AgRP)的表达,探讨应激依赖性的食欲变化机制。
1 材料和方法 1.1 动物模型的构建与分组C57BL/6小鼠,雄性,6~8周龄,体重18~22 g,由上海杰思捷实验动物有限公司[动物生产许可证号:SCXK(沪)2018-0004]提供。将小鼠随机分为对照(Ctrl)组(n=16)和应激(CUMS)组(n=16)。小鼠在12 h光照/12 h黑暗循环、温度20~25 ℃、相对湿度65%~75%、自由摄食和饮水的条件下饲养1周后进行实验。
CUMS组小鼠每周随机进行7种应激(味道刺激、昼夜颠倒、束缚、潮湿垫料、空笼、频闪、强光照射36 h[3]),连续11周,建立CUMS模型。对照组正常饲养。记录小鼠摄食量和体重。通过悬尾实验和强迫游泳实验检测小鼠抑郁样行为,验证模型是否建立成功。模型建立成功后(第12周),从两组各随机取8只小鼠收集全脑、下丘脑组织;两组各剩余的8只小鼠重新编组为应激停止(C-CUMS)组和应激停止对照(C-Ctrl)组,继续观察3周后,于第15周取全脑、下丘脑组织。全脑组织立即放入多聚甲醛溶液固定,随后进行石蜡包埋、切片;下丘脑组织立即放于-80 ℃冰箱保存待测。
1.2 qPCR检测小鼠下丘脑食欲调节因子mRNA的表达取小鼠下丘脑组织放于1.5 mL离心管中,加入1 mL RNAiso Plus裂解液(货号9109,日本TaKaRa公司),使用组织研磨机研磨;匀浆后置于冰上,加入200 μL氯仿(货号67-66-3,昆山金城试剂有限公司),用漩涡振荡器剧烈震荡15 s后,4 ℃、16 000×g离心15 min;取上清液,加入500 μL异丙醇(货号67-63-0,上海麦克林生化科技股份有限公司),混合均匀,4 ℃静置10 min后,4 ℃、16 000×g离心15 min;弃上清液,加入1 mL 75%乙醇(山东利尔康医疗科技股份有限公司)漂洗后,4 ℃ 6 300×g离心5 min;弃上清液,室温干燥25 min至沉淀透明,加入DEPC水[货号B501005-0500,生工生物工程(上海)股份有限公司]溶解RNA。将获得的RNA按照反转录试剂盒(货号RR036A,日本TaKaRa公司)的步骤操作,获得cDNA。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参,采用qPCR法检测小鼠下丘脑食欲调节因子OX1R、LEPR、AgRP mRNA的表达。β-actin正向引物5'-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3',反向引物5'-ATGCCACAGGATTCCATACC-3';OX1R正向引物5'-CAGGCTTTGTGCAAGGTCAT-3',反向引物5'-CTTGAACAACAGTGGGTGGC-3';LEPR正向引物5'-ATGACGCAGGGCTGTATGTC-3',反向引物5'-TGGACTGTTGGGAAGTTGGTAG-3';AgRP正向引物5'-GGAAGCAGTCACGTGTGGACCC-3',反向引物5'-AGTGGAGCCACGCCCATCTGG-3'。按照试剂盒(货号RR420A,日本TaKaRa公司)说明书配制扩增体系(20 μL):TB Green Premix Ex Taq 10 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL,DNA模板2 μL,灭菌水6.8 μL。将扩增体系分别加入八联管,使用QuantStudio 1荧光定量PCR仪(美国赛默飞公司)进行检测。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
1.3 免疫组织化学染色检测小鼠下丘脑AgRP和LEPR蛋白的表达取小鼠全脑组织切片,经二甲苯、无水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇脱蜡至水后,用PBS缓慢振荡洗涤5次、每次3 min;室温下于通透液中浸泡15 min,用PBS缓慢振荡洗涤6次、每次5 min;通过煮沸法进行抗原修复,将切片置于沸水浴中20 min,冷却至室温后用PBS缓慢振荡洗涤6次、每次5 min;加入内源性过氧化物酶阻断剂(3%过氧化氢溶液)孵育15 min,用PBS缓慢振荡洗涤5次、每次3 min;采用山羊血清在室温下孵育10 min;加入稀释好的一抗(LEPR抗体:货号20966-1-AP,武汉三鹰生物技术有限公司;AgRP抗体:货号ab254558,英国Abcam公司),4 ℃孵育过夜;第2天在室温下复温30 min,用PBS缓慢振荡洗涤5次、每次3 min,洗去未结合的一抗;加入对应一抗种属的二抗试剂(货号PV-9001,北京中杉金桥生物技术有限公司),室温孵育25 min,用PBS缓慢振荡洗涤5次、每次3 min;加入HRP标记的链霉卵白素试剂,室温孵育15 min,用PBS缓慢振荡洗涤5次、每次3 min;避光加入按比例稀释的DAB显色剂,室温孵育,在显微镜下观察5~15 min,发现变色后放入自来水中终止显色,用PBS缓慢振荡洗涤5次、每次3 min;用苏木精染核30 s;加入5%冰乙酸分化30 s;流水冲洗1 h;70%、80%、90%、100%乙醇分别冲洗30 s;二甲苯浸泡1 min;中性树脂封片。
1.4 统计学处理应用GraphPad Prism 8.3.0软件进行数据分析和绘图。呈正态分布的计量资料以x±s表示,任意两组间的比较采用独立样本t检验。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 CUMS对小鼠摄食量及体重的影响CUMS组小鼠第2~11周累积摄食量均高于Ctrl组(均P<0.05,图 1A),11周内两组小鼠体重差异无统计学意义(均P>0.05,图 1B)。有趣的是,停止应激3周后,第15周时C-CUMS组小鼠累积摄食量少于C-Ctrl组(P<0.05,图 1C)。第11周时CUMS组和Ctrl组小鼠体重差异无统计学意义(n=16,P>0.05,图 1B),但C-CUMS组第11~15周体重均低于C-Ctrl组(n=8,均P<0.05,图 1D)。以上结果表明CUMS对小鼠的食欲有重要影响。
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图 1 各组小鼠累积摄食量和体重的变化 Fig 1 Changes of cumulative food intake and body weight of mice in each group A, C: Changes of cumulative food intake; B, D: Changes of body weight. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Ctrl group at the same week; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs C-Ctrl group at the same week. n=16 in Ctrl and CUMS group, n=8 in C-Ctrl and C-CUMS group, x±s. Ctrl: Control; CUMS: Chronic unpredictable mild stress; C-Ctrl: Cessation-control; C-CUMS: Cessation-CUMS. |
2.2 CUMS模型验证
采用悬尾实验和强迫游泳实验评价小鼠抑郁样行为,CUMS组小鼠的悬尾不动时间和水中漂浮时间均长于Ctrl组小鼠[(42.82±8.07)s vs(26.48±6.44)s,(223.01±14.27)s vs(165.12±20.39)s,均P<0.01]。以上实验结果表明小鼠出现了明显的抑郁样行为,CUMS模型构建成功。
2.3 CUMS对小鼠下丘脑组织中食欲调节因子表达的影响qPCR检测结果(表 1)显示,CUMS组小鼠下丘脑组织中OX1R mRNA和AgRP mRNA表达量较Ctrl组升高(均P<0.01),LEPR mRNA表达量较Ctrl组下降(P<0.01)。停止应激3周后,C-CUMS组与C-Ctrl组小鼠下丘脑组织中OX1R mRNA和AgRP mRNA表达量差异均无统计学意义(均P>0.05),但C-CUMS组LEPR mRNA表达量较C-Ctrl组升高(P<0.01)。以上实验结果表明,CUMS导致下丘脑组织中促食欲因子OX1R mRNA和AgRP mRNA表达量升高、抑食欲因子LEPR mRNA表达量降低,应激停止后LEPR mRNA表达水平提高,提示食欲调节因子在CUMS导致的食欲变化中起着重要作用。
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表 1 qPCR检测各组小鼠下丘脑组织中食欲调节因子的mRNA相对表达量 Tab 1 mRNA expression of appetite-regulating factors in hypothalamus of mice in each group detected by qPCR |
免疫组织化学染色结果显示,CUMS组小鼠下丘脑弓状核中AgRP蛋白表达水平较Ctrl组升高(P<0.05),而C-CUMS组与C-Ctrl组比较小鼠下丘脑弓状核中AgRP蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),见图 2。以上结果表明CUMS激活了小鼠下丘脑弓状核中的AgRP神经元。
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图 2 各组小鼠下丘脑弓状核AgRP免疫组织化学染色结果 Fig 2 Immunohistochemical staining of AgRP in hypothalamic arcuate nucleus of mice in each group A-D: Representative immunohistochemical staining images (A: Ctrl group; B: CUMS group; C: C-Ctrl group; D: C-CUMS group); E: AgRP positive area in Ctrl group and CUMS group; F: AgRP positive area in C-Ctrl group and C-CUMS group. *P < 0.05. n=3, x±s. AgRP: Agouti-related protein; Ctrl: Control; CUMS: Chronic unpredictable mild stress; C-Ctrl: Cessation-control; C-CUMS: Cessation-CUMS. |
免疫组织化学染色结果显示,CUMS组小鼠下丘脑弓状核中LEPR蛋白表达水平较Ctrl组下降(P<0.01),而C-CUMS组小鼠下丘脑弓状核中LEPR蛋白表达水平较C-Ctrl组升高(P<0.01),见图 3。以上结果提示应激停止后小鼠下丘脑弓状核中LEPR可能在小鼠食欲变化中发挥关键作用。
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图 3 各组小鼠下丘脑弓状核LEPR免疫组织化学染色结果 Fig 3 Immunohistochemical staining of LEPR in hypothalamic arcuate nucleus of mice in each group A-D: Representative immunohistochemical staining images (A: Ctrl group; B: CUMS group; C: C-Ctrl group; D: C-CUMS group); E: LEPR positive area in Ctrl group and CUMS group; F: LEPR positive area in C-Ctrl group and C-CUMS group. **P < 0.01. n=3, x±s. LEPR: Leptin receptor; Ctrl: Control; CUMS: Chronic unpredictable mild stress; C-Ctrl: Cessation-control; C-CUMS: Cessation-CUMS. |
3 讨论
研究者会根据研究目的选择合适的应激模型,比如CUMS主要涉及味道刺激、昼夜颠倒、束缚、潮湿垫料、空笼、频闪、强光照射36 h等比较温和的刺激,实验时间较长,一般持续2~4个月[3];慢性束缚应激每日给予小鼠3~4 h的束缚刺激,应激周期控制在2~3周[4];睡眠剥夺应激每日对小鼠进行8~12 h的睡眠剥夺,应激周期为1~2周[5]。本实验选择CUMS为应激模型,既很好地模拟了机体在应激状态下心理和生理的变化,又避免了造模本身对躯体的直接损伤。
应激对食欲的影响具有不确定性,有研究表明应激会导致食欲下降[6],也有研究表明应激会导致食欲上升[7]。本研究结果发现,应激第2~11周CUMS模型小鼠的摄食量较对照组小鼠升高,而在第12周应激停止后C-CUMS组小鼠摄食量有降低的趋势,并在第15周表现出与C-Ctrl组差异有统计学意义,表明CUMS对小鼠的食欲有重要影响。
下丘脑是大脑中调节全身内稳态的重要区域,是机体中枢维持能量平衡的核心,对食欲调节有重要影响[8]。已确定与食欲相关的调节因子如AgRP和促食欲素等具有促进摄食的作用,而阿片黑素促皮质激素原(pro-opiomelanocortin,POMC)、黑皮质素及瘦素具有抑制摄食的作用[9-10]。下丘脑中的AgRP是增加食欲的主要调节因子,在摄食和能量平衡中起着重要作用[11]。本研究中,CUMS组小鼠AgRP mRNA表达量和蛋白表达水平均高于Ctrl组,而C-CUMS组与C-Ctrl组比较差异无统计学意义,提示CUMS小鼠食欲调节机制可能与AgRP有关。
食欲素是一种在神经系统内广泛分布的神经肽类物质,与其受体结合后激活下游信号通路,进而参与调节摄食的生理过程[12]。食欲素以2种形式存在,即食欲素A(orexin-A)和食欲素B(orexin-B)。食欲素受体有2种亚型,即OX1R和食欲素2型受体(orexin 2 receptor,OX2R)。OX1R只对食欲素A具有亲和力,而OX2R对食欲素A和食欲素B具有相同的亲和力。与食欲素B和OX2R相比,食欲素A和OX1R在调节摄食行为方面的作用更大。有趣的是,食欲素在增加食物摄入量的同时也会增加能量消耗,导致体重下降[13-14]。本研究中CUMS组小鼠OX1R mRNA表达量高于Ctrl组,C-CUMS组与C-Ctrl组OX1R mRNA表达量的差异无统计学意义。这一结果与CUMS导致小鼠摄食量增高的情况一致,而小鼠体重无明显变化。由此推测,CUMS后小鼠食欲上升、体重却无明显变化,食欲素很可能发挥了关键作用。
瘦素是白色脂肪细胞分泌的一种蛋白质,被认为是多种生理过程(包括食欲和能量代谢)的主要调节因子之一。它通过与多种受体结合的方式调节食物的摄入,可与下丘脑中的LEPR相结合抑制食欲,也可通过多种信号转导途径作用于POMC神经元,促其产生抑制食欲的α-黑素细胞刺激素,同时亦可作用于AgRP神经元并抑制其产生促进食欲的AgRP,引起食欲降低、机体能量消耗增加[15-17]。本研究中CUMS组小鼠LEPR mRNA和蛋白的表达水平均低于Ctrl组,而C-CUMS组LEPR mRNA和蛋白的表达水平均高于C-Ctrl组,表明应激停止后小鼠食欲下降的机制可能涉及LEPR的功能调节,但相关调节通路还有待进一步研究。一般生理状态下体重的升降与摄食量多少呈正相关,本研究发现应激导致小鼠摄食量增加时体重却没有升高,可能跟应激诱导的代谢稳态失衡有关。小鼠应激时摄取的依然是标准饲料,不能补偿应激所消耗的能量,所以体重没有增加。我们推测应激时AgRP可能抑制了瘦素与LEPR的结合,产生了促进食欲的作用。
综上所述,本研究初步证明CUMS导致小鼠食欲上升,其机制可能与LEPR和AgRP的功能调节有关;应激停止后小鼠食欲下降且体重降低,LEPR可能在此过程中发挥了重要作用。
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